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明胶是胶原的热变性和不可逆的化学降解产物,按用途不同可分为照相明胶、药用明胶、食用明胶和工业明胶,作为配料剂、悬浮剂、粘合剂、成型剂等广泛应用于各领域。传统意义上的商品化明胶作为一种屠宰场的副产品,主要通过物理化学方法提取,源于各种品种、来源和年龄的动物(每一批都不同),经过前处理后,明胶在-系列条件下序列是变化的。这样不同生产批次的明胶不相同并且具有不同的特性,再加上提取出来的明胶具有病毒和朊病毒的潜在污染的风险,难以完全保证其产品安全性,而重组DNA是获得明胶的另一种策略,这种策略通过表达具有特定长度和组成的胶原基因片段直接产生明胶,能够提供具有稳定的和可预测的特性以及具有确切分子组成的明胶。目前重组明胶由于没有引入外源脯氨酸羟化酶基因,因此都未能发生羟化,即使有的物种具有内源羟化能力,但羟化程度较低,从而不能形成坚固的三螺旋结构,在细胞内很容易降解,以至于不能较快地分泌到细胞外。本论文通过引入外源脯氨酸羟化酶基因,构建多基因(明胶基因、脯氨酸羟化酶基因)共表达载体实现了在毕赤酵母中重组羟基化明胶的表达,并且获得了一定羟基化比例的明胶。在构建的载体中,三个独立表达盒串联在一起,每一个表达盒都有自己的启动子和终止子,分别转录出各自的mRNA并翻译出不同的蛋白,同时在每一个表达盒中,我们选用了毕赤酵母的两种强诱导型启动子(PAOX1和PFLD1)分别作为这些基因的启动子元件。主要工作有以下几个方面：1.通过重叠延伸PCR方法合成了一段长约300bp的编码100个氨基酸(第531-630)的人Ⅰ型胶原蛋白alpha(1)链明胶基因(Genebank登录号：P02452)；2.成功克隆了构成表达盒中的各个元件,其中PFLD1启动子元件是以毕赤酵母基因组为模板扩增获得,同时用绿色荧光蛋白的表达检测了启动子的功能,αMF信号肽和TT(终止子)元件都是以表达载体pPIC9K直接作为模板分别扩增获得,脯氨酸羟化酶基因(αP4H和β)分别是以含有各自编码基因的cDNA克隆为模板扩增获得；3.重点构建了多基因表达载体,将明胶基因以及脯氨酸羟化酶基因(αP4H和p)同时引入到同一个毕赤酵母表达载体pPIC9K上。首先获得含有各元件的T-载体,然后通过酶切连接方法将相邻的两个含有元件的T-载体依次连接组装在同一个pGEM-T载体上,最后将整个表达框从T载体上切下后移入到表达载体pPIC9K上；4.表达载体用SalⅠ线性化后,经电转化通过基因同源交换,整个表达框被整合到毕赤酵母KM71染色体中,长出的转化子都是甲醇利用慢型,用含有4mg/L G418的MD平板筛选后获得高拷贝菌株,经过甲醇诱导后,目的蛋白具有较强的诱导表达模式,分子量是单体(未羟化的明胶)的三倍左右,蛋白经LC-MS/MS检测与人胶原蛋白Ⅰ型相匹配,并且检测到在Gly-X-Y三联体的Y位置上大约有66%左右的脯氨酸发生了羟化作用；5.对重组明胶的微生物生产进行了初步的发酵条件优化工作,诱导时间做到第六天时产量还有增长趋势,因此在诱导时间上可能还有进一步增产的空间,甲醇添加浓度以1%(每12小时一次)为最佳浓度。并且对表达的重组明胶进行了鉴定及表征工作。经圆二色谱检测,明胶的二级结构含有61.5%的β转角和38.5%的无规则卷曲,而不含传统的α螺旋和β折叠。明胶的核磁共振波谱检测结果表明：1H谱和13C谱都有与之相对应的特征性位移峰。明胶的紫外光谱显示它的最大吸收峰在225nm处。