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【目的】构建噬菌体展示肽库,筛选出大肠癌早期检测分子标志群,确定临床可以使用的诊断大肠癌的分子标志。【方法】(1)构建大肠癌噬菌体展示肽库：收集30例上海长海医院肛肠外科手术后立即冻存的大肠癌组织标本。用Trizol法抽提总RNA,用mRNA提取试剂盒结合poly(A)的磁珠提取mRNA,通过OrientExpression cDNA和Cloning System两个试剂盒进行反转录、末端平齐、片段长短筛选、加接头、双酶切、加双臂、体外包装等步骤,成功地构建了大肠癌噬菌体展示肽库。(2)大肠癌特异性的相关肽的富集：我们进行了正反向的五轮亲和筛选以富集可以和大肠癌自身抗体相结合的特异的展示肽。(3)大肠癌特异性标志物的筛选：随机挑选了五轮筛选后的2000个噬菌体克隆进行ELISA初筛。96孔酶标板用1：10000稀释的T7 tailer抗体包被,经洗涤、封闭、洗涤、加噬菌体液、加血清、洗涤、加HRP耦联的羊抗人IgG、洗涤、显色、终止等步骤,在波长450nm下通过酶标仪读取OD值。大肠癌组为阳性、对照组为阴性的噬菌体即为有意义的、可能具有诊断价值的样本。(4)测序和蛋白质功能预测：通过ELISA筛选出的噬菌体克隆,测序后经过NCBI上的BLAST序列对比找到完全一致的或者最接近的已知基因序列,从而推测我们所获得的基因与癌症是否相关。(5) ELISA复筛：经测序及比对后,共20个克隆用30例大肠癌患者血清及30例对照患者血清进行ELISA复筛。方法同ELISA初筛。(6)ELISA验证：经ELISA复筛后,挑选出有代表性的5个克隆,用60例大肠癌患者血清及60例对照患者血清进行ELISA验证。方法同ELISA初筛。(7)免疫组化验证：对COX6B1进行免疫组化验证,采用EnVision二步法进行。【结果】(1)构建的大肠癌噬菌体展示肽库的滴度为3.0×106pfu。随机挑选20个噬菌体斑进行PCR鉴定其重组率为60%。(2) ELISA初筛共筛选出22个有意义的噬菌体克隆,其中871号噬菌体扩增失败。获得其它21个克隆测序结果后,发现其中有2个基因测序失败,5个为未知功能的基因,在已经研究过的基因中有报道有11个基因与肿瘤相关。21个基因中有一组相同基因,分别为73和1048号。(3) ELISA复筛后挑选出具有代表性的5个克隆,分别为95号、149号、174号、396号及1009号。(4) ELISA验证可见95号、149号、174号、396号及1009号噬菌体诊断大肠癌的ROC曲线下面积分别为0.763,0.669,0.790,0.742,0.796(所有P<0.05)。其联合检测大肠癌的敏感度为95%(P<0.001),特异度为69%(P<0.001),其ROC曲线下面积为0.886,95%可信区间为(0.827,0.945)。(5)免疫组化结果显示COX6B1在大肠癌组织表达显著高于正常粘膜组织。经统计两者间有显著性差异(P<0.001)。【结论】(1)T7噬菌体展示肽库的构建可以很好的展示各种小丰度的蛋白。(2)五轮亲和筛选可富集表达大肠癌特异抗原的噬菌体克隆。(3) ELISA初筛、复筛及验证得出的一组噬菌体特异表达的抗原可作为大肠癌诊断分子标志群。