论文部分内容阅读
白头翁为毛茛科植物白头翁Pulsatilla chinensis(Bunge)Rege的干燥根。三萜皂苷类是白头翁中的主要成分,研究表明白头翁皂苷具有抗肿瘤,抗炎,抗菌,舒张血管等一系列药理活性。本文对白头翁皂苷的提取分离工艺进行优化,利用HPLC-Q/TOF-MS/MS对白头翁皂苷的成分进行初步分析鉴定,并通过日间及日内精密度,准确度,稳定性等方法学验证,建立了灵敏度高,选择性好的液质联用检测体内药代动力学常数的方法,并结合体外代谢实验,对大鼠口服白头翁皂苷后的体内过程进行探究,为研究白头翁皂苷作用机制及开发现代中药奠定基础。取得以下主要结果:1.白头翁皂苷提取制备工艺的确定通过溶剂筛选,正交试验,大孔树脂型号筛选,确定白头翁皂苷的提取分离工艺为:70%乙醇,8倍量溶剂回流提取3次,每次1.5小时,过D101型大孔树脂分离,40%乙醇除去杂质,收集90%乙醇洗脱部位,干燥后即可得到白头翁总皂苷。2.白头翁总皂苷成分分析采用HPLC-MS/MS-Q/TOF质谱对白头翁的化学成分进行鉴别与结构解析。首先对已有对照品的白头翁皂苷进行裂解规律总结,发现其是通过一系列的脱糖反应,得到m/z 473的母核离子碎片,继续脱去两分子水,最终得到m/z 437的离子碎片。根据以上裂解规律,结合白头翁皂苷提取物的质谱检测结果,得到的化合物精确分子量,与建立的白头翁化学成分数据库做对比,鉴定出 pulsatilloside E,3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-anemosapogenin-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1 →6)-β-D-glucopyranoside,3-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1 →4)]-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 等 17 个白头翁皂苷类成分。3.白头翁总皂苷药代动力学研究定量分析白头翁总皂苷中3种待测成分的含量和大鼠口服白头翁总皂苷后3种成分在肝门静脉、肝脏和全身血的暴露量等药动学行为。结果表明,白头翁皂苷提取物中3种成分含量从高到低的顺序依次为Anemoside B4(1)>Anemoside A3(0.032)>Anemosapog e-nin(2.3*10-4);大鼠口服白头翁皂苷提取物后3种成分的肝门静脉血暴露量顺序为An e-mosapogenin(1)>Anemoside B4(0.34)>Anemoside A3(0.0058);肝脏中的暴露量顺序为,Anemosapogenin(1)>Anemoside B4(0.13),未检测到 Anemoside A3;在全身血中暴露量顺序为 Anemosapogenin(1)>Anemoside B4(0.86)>Anemoside A3(0.012)。结合体外原代肝细胞实验和肠道菌实验的结果,推测3种成分在体内的过程:大鼠口服白头翁皂苷提取物后,在白头翁皂苷提取中含量高的Anemoside B4在肠道菌作用下可代谢生成Anemoside A3和Anemosapogenin,吸收进入肝门静脉血后大部分的An-emoside B4进入全身血循环系统,仅有少数进入肝脏,其在肝脏中不进行代谢。Anemo-side A3在肠道菌作用下代谢生成Anemosapogenin,从肝门静脉血通过肝脏后,大部分可进入全身血循环系统,肝脏中并不代谢。Anemoside B4和Anemoside A3的代谢物A-nemosapogenin通过肝门静脉血后,可进入全身血循环,并在肝脏中大量聚集,还有部分可在肝脏中代谢或外排,通过原代肝细胞实验可以验证,Anemosapogenin在肝细胞中可以被代谢。我们发现原本药材中含量微小的Anemosapogenin进入体内,包括肝门静脉血(入肝前)-肝脏(重要的靶点器官和代谢器官)-全身血,反而变为体内暴露量最高的化合物,并且可以在肝脏发生代谢反应。结合体外肠道菌代谢实验发现,药材中暴露量高的Anemoside B4和Anemoside A3在肠道菌作用下,发生脱糖反应,大量生成为Anem osapogenin,导致体外含量和体内暴露量之间有较大的差异。Anemosapogenin不仅在体内有很大暴露量,且其具有抗肿瘤等药理活性,说明Anemosapogenin很可能为白头翁皂苷在体内发挥一系列药理作用的主要药效物质。