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慢性髓细胞白血病（CML）是一种起源于多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，其遗传学特点是具有特征性的费城染色体，并由此产生bcr／abl融合基因，其表达的BCR／ABl融合蛋白具有独特的氨基酸序列，可作为CML的肿瘤特异性抗原。近来研究证实，含有BCR／ABL蛋白融合点的某些短肽可被HLA-Ⅰ和Ⅱ类分子递呈，并被细胞毒性T淋巴细胞（CTL）及辅助性T细胞（TH）识别，从而为CML的细胞免疫治疗提供了有利依据。然而，由于CML患者存在免疫功能障碍，包括CML细胞缺乏B7协同刺激分子及HLA分子缺陷等，不能产生有效的细胞免疫应答。因此，人们一直寻求体外激活CTL细胞的方法。尽管有研究用基因转染或抗原肽负载抗原呈递细胞（APC）等方法体外激活CTL细胞，但由于其本身存在的缺陷使其应用受到限制。 近来研究发现，HIV-1病毒的反式激活蛋白（TAT）中一个富含精氨酸的多肽片段TAT48-60（GRKKRRQRRRPPQ）具有跨膜转导蛋白的功能，被称为蛋白转导结构域（PTD）。其转导作用不是通过经典的受体、吸收介导的内吞方式，而是采用一种独特的迄今不明的方式进行的，且具有快速、高效、广谱的特点。 本研究采用这一新的PTD蛋白转导技术，探讨其介导外源性可溶性BCR／ABL蛋白导入APC内参与内、外源性抗原呈递途径，体外激活抗原特异 第四军医大学硕士学位论文性CTL及T。细胞的免疫原性作用。 第一部分实验，我们首先将 PTD－BCR／ABL蛋白与比一60、C2C12、SWC刁 721、HHCC细胞共孵育，之后用免疫组化染色法检测细胞内PTD－BCR／ABL蛋白，流式细胞仪（FCM）分析孵育不同时间，细胞内阿D－BCR／ABL蛋白的阳性检出率及检测量。另外，经小鼠尾静脉注射伊文思蓝溶液及PTD干CR从BL蛋白，6 h后取全脑、肝、脾、心、肾组织，制备冰冻切片，免疫组化染色检测 PTD－BCR／ABL蛋白的组织分布。 第二部分实验，我们将PTD－BCR／ABL蛋白与CML患者外周血单个核细胞（PBMO体外共孵育，FCM分别检测CD4”、CDS”T细胞的早期活化抗原CD69的表达。用阿D－BCR／ABL蛋白及BCR／ABL蛋白免疫接种BALB／C小鼠4次，采集不同时间免疫血清，ELISA法测定抗体的吸光度M）值。 实验结果显示：（l）HL－60、CZC12、SMMC－7721、HHCC 细胞与PTD8CfoABL蛋白共孵育后，在细胞胞浆及胞核内免疫组化染色均检测到PTD－BCR／ABL蛋白，尤以细胞核明显。而BCR／ABL对照组细胞均无阳性染色。u)在 PTD丑C伽BL蛋白对 HL七0细胞 72h的转导过程中，其一直稳定保持着较高的阳性转导率。在1．sh时即已达到77％，3h时高达94．52％。而细胞的蛋白转导量则随着时间推移有明显的变化。在转导初期其随着时间延长逐渐增大，在6h时达到最高，之后其逐步减低，72h时己降至最高值的一半以下。（）PTD－BCIUABL实验组小鼠的肝、脾、心肌、肾脏及脑等组织细胞中免疫组化染色均检测到PTD－BCR／ABL蛋白，其分布无组织特异性，而脑组织未见伊文思蓝荧光着色／4)终浓度为 100 mg儿的 PTD士CR从BL抗原体外刺激 3天后，15例检测的 CML患者中，10例表现为＊”T细胞早期活化，4例表现为CD4”T细胞早期活化，其中有3例m“和CD4”T细胞同时活化；而对照的sin／朋L抗原刺激组无1例表现ms”或m丫T细胞活化。 （5）PTD．BCR／ABL及 BCR／ABL蛋白免疫小鼠均能产生抗 BCWABL蛋白 ．4． 第四军医大学硕士学位论文抗体，两组间 A值无显著性差异（P＞0刀5）。 以上结果提示：PTD－BCR／ABL蛋白具有稳定、高效的蛋白转导功能。PTD能将外源性BCR／ABL抗原导入APC内，加工、处理、呈递后激活抗原特异性CDS”及m4”T细胞，为规L特异性口L及T。细胞的体外活化及细胞免疫治疗开辟一条新的途径。