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依赖磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移系统（phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system,PTS)是细菌中常见的一种对糖类摄取的复合酶体系。这一系统的特征是在对糖类摄取的过程中常常会伴随着对糖的磷酸化。PTS一般由两个非特异性蛋白——酶Ⅰ(enzymesⅠ,ⅠE)、Hpr(histidine phosphocarrier protein),和一个具有糖类特异性的酶Ⅱ(enzymesⅡ,ⅡE)复合体组成。酶 II复合体通常由三个亚基组成,即ⅡA亚基、ⅡB亚基(EC:2.7.1.69)和一个膜通道蛋白IIC亚基。目前,对于PTS中的ⅡB亚基在三维结构和其磷酰基转移机制的研究已比较深入,而且对其调控功能的研究也开始涉及,但是对于ⅡB亚基的兼职功能的研究还没有相关报道。 本课题组在前期研究β-葡萄糖苷酶过程中,构建了 Exiguobacterium sp.GXG2的DNA文库,其中一株阳性克隆中命名为pGEMB0的重组质粒除了含有β-葡萄糖苷酶基因外,同时还可能含有一个编码依赖磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移系统酶Ⅱ的B亚基的基因,对这个基因命名为ptsB。通过信息学分析,结果显示:基因ptsB由309个碱基构成,编码含有102个氨基酸残基数的多肽,预测其相对分子质量为11,073 Da,理论等电点为5.07;在核苷酸水平上,ptsB与Exiguobacterium sp.MH3和Exiguobacterium sp.AT1b的全基因组上序列的一致性分别为97％和84%;PtsB在氨基酸水平上与来自Exiguobacterium sp.MH3的cytochrome C biogenesis protein CcmE(GenBank登录号:YP_008802155.1)和来自Exiguobacterium sp.S17的PTS system lactose/cellobiose-specific transporter subunitⅡB(GenBank登录号:WP_016510544.1)的一致性最高,分别为99%和93%。 利用质粒pET-28a(+)构建含有ptsB基因的重组表达质粒pETPB,导入表达宿主菌株E.coli Rosseta(DE3)中构建重组菌株。通过把构建成功的重组菌株 Rosseta(DE3)/pETPB接种至柠檬酸铁铵-七叶苷液体培养基进行功能鉴定,证实了重组蛋白 PtsB具有水解β-1,4糖苷键的功能。然后对Rosseta(DE3)/pETPB进行诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化出重组蛋白PtsB。对PtsB进行生化性质研究,结果显示:在以p-NPG做为底物时,PtsB的β-葡萄糖苷酶活性的最适反应温度为45℃,最适pH为8.0;在最适反应条件下,PtsB的比活力为1.01 U/mg;二价的金属阳离子对PtsB的活性有比较显著的影响,其中Fe2+离子对PtsB的活性起到明显的促进作用,Ca2+、Mn2+和Mg2+也起到一定的促进作用,而Cu2+和Zn2+对PtsB的活性具有明显的抑制作用;金属螯合剂EDTA是PtsB的强抑制剂,0.5 mM的ETDA可以使PtsB失活;动力学参数分析结果显示:PtsB对p-NPG的Km为0.57 mM,转换数kcat为0.48/s。 本研究证实了Exiguobacterium sp.GXG2中的依赖磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移系统酶Ⅱ的B亚基具有水解β-1,4糖苷键这一兼职功能,拓宽了ⅡB亚基的功能范围,并为蛋白质的研究提供新的思路。