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环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新颖的核酸扩增技术,该技术以其灵敏度高、特异性强、反应速度快、检测成本低等优点已广泛应用于各种病原体的检测,但在环境污染监测方面的应用则较少。
本文以我国海洋经济鱼类褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)为研究对象,克隆了四种热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)——HSP60、HSC70、HSP70和HSP90基因序列,分别建立并优化定量LAMP技术。为验证定量LAMP技术的可行性,将褐菖鲉分别暴露于20μg·L-1、60μg·L-1和180μg·L-1原油水溶性成分(water soluble fraction,WSF),第1、5、10d采样,利用定量LAMP技术检测肝HSPs基因的表达情况,并与Real-time PCR结果进行比较。
主要研究结果如下:
(1)建立了HSPs的LAMP检测方法,并对其中的几个重要参数进行了优化。结果表明,Mg2+最佳浓度为8 mmol·L-1,外引物与内引物浓度比为1:6时效果最好,最适反应温度为64℃,最佳反应时间为50 min,甜菜碱最佳浓度为0.4mol·L-1,dNTP最佳浓度为1.4 mmol·L-1。
(2)本实验以HNB为染料,建立了定量LAMP检测技术,对其灵敏度进行摸索发现,检测限为4.74×104 copies,而Real-time PCR的检测限为2.75 copies。虽然LAMP的灵敏度低于Real-time PCR,但是LAMP反应快,成本低,耗时短,只需简易的实验设备,更适用于现场的快速检测。
(3)原油WSF短期毒性实验结果表明,LAMP的检测结果与Real-time PCR的基本一致,表明该方法可用于实际样品的快速检测;不同浓度原油WSF暴露下,不同HSPs基因mRNA的表达变化趋势不一致,其中对WSF敏感性和特异性较好的是HSP60和HSC70基因。