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研究背景脂肪因子 Vaspin(visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor)发现于2000年,主要由腹腔内脏脂肪组织分泌并释放至血液循环,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员之一,被证实与糖脂代谢调节和胰岛素增敏有关。近年来有研究表明,外周血液循环中vaspin的分泌水平与冠心病的发病率、冠状动脉病变血管的数目有一定关联。冠心病患者vaspin的分泌水平低于健康人群,而心肌梗死患者则更低。循环中低水平的vaspin与冠心病患者的不良预后也有一定的关联,然而其中具体影响机制未见相关报道。因此,我们推测脂肪因子vaspin可能在病理条件下对心肌细胞发挥一定保护作用,但其中具体机制有待进一步探索。在本研究中,我们利用vaspin过表达病毒和外源性重组vaspin蛋白,分别在动物和细胞水平上进行了相关实验,探讨在心肌缺血再灌注条件下vaspin是否能发挥心肌细胞保护作用,减轻心肌缺血再灌注(ischaemia/reperfusion,I/R)损伤。研究目的1.研究脂肪因子vaspin对心肌I/R损伤的影响;2.探讨脂肪因子vaspin作用于心肌细胞影响心肌I/R损伤的具体分子机制,为临床上改善心肌梗死患者的预后提供进一步的理论支持。研究方法一、体内(动物学)实验1.尾静脉注射携带有vaspin或绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因的腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV),构建vaspin过表达或对照小鼠模型,蛋白印迹法和ELISA法分别检测小鼠内脏脂肪组织和外周血液循环中的vaspin水平;2.建立小鼠心肌缺血再灌注损伤模型实验分组:AAV-GFPsham,AAV-vaspinsham,AAV-GFPI/R,AAV-GFP+氯喹(chloroquine,CQ)I/R,AAV-vaspin I/R,AAV-vaspin+CQI/R,其中 I/R处理的4个组各有5只小鼠留待4周后超声检测心功能;3.TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium,TTC)染色法检测I/R后各组小鼠心肌梗死面积;4.小动物超声检测I/R后各组小鼠心功能变化;5.DCFH-DA法检测I/R后各组小鼠心肌活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;6.免疫组织化学法检测I/R后各组小鼠心肌组织LC3B、LAMP2等蛋白的表达;7.蛋白印迹法检测各组小鼠I/R后心肌组织bcl-2、cleavedcaspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、溶酶体相关膜蛋白(lysosome-associated membrane protein 2,LAMP2)和β-actin等蛋白的表达水平。二、体外(细胞学)实验1.建立 H9C2 细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型实验分组:① dilution normoxia,vaspin normoxia,dilution H/R,vaspin H/R;② dilution H/R,vaspin H/R,CQH/R,vaspin+CQH/R;③ dilution H/R,vaspin H/R,Compound C H/R,vaspin+ Compound C H/R;2.TUNEL法检测各组H9C2细胞H/R后的凋亡水平;3.DCFH-DA法检测各组H9C2细胞H/R后的ROS水平;4.细胞免疫荧光法检测各组H9C2细胞H/R后LC3、LAMP2等蛋白的表达;5.利用mRFP-GFP-LC3腺病毒转染H9C2细胞检测自噬小体的形成和自噬溶酶体的融合;6.蛋白印迹法检测各组小鼠I/R后心肌组织bcl-2、bax,cleavedcaspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、LAMP2、p-AMPK/AMPK 和 β-actin 等蛋白的表达水平。研究结果1.AAV-vaspin减少小鼠心肌I/R后梗死面积,改善I/R后小鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)及短轴缩短率(fractional shortening,FS),减少心肌组织凋亡和活性氧水平;2.AAV-vaspin上调小鼠心肌I/R后心肌组织中自噬流水平,在vaspin过表达的基础上I/R术前加用自噬流阻断剂-CQ,vaspin的心肌保护作用被削弱,表现为心肌梗死面积增加,LVEF及FS降低,心肌组织凋亡和活性氧水平加重;3.外源人重组vaspin蛋白可减少H/R后H9C2细胞凋亡和活性氧水平;4.外源人重组vaspin蛋白可增强H/R后H9C2细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62和LAMP2的表达以及增加自噬小体和自噬溶酶体的形成,上调自噬流水平,应用CQ后H9C2细胞自噬流被阻断,细胞凋亡和氧化应激水平增加;5.外源人重组vaspin蛋白激活AMPK-mTOR通路上调H9C2细胞自噬流进而发挥心肌细胞保护作用,应用AMPK抑制剂-Compound C后H9C2细胞自噬流被抑制,凋亡和活性氧水平增加。研究结论1.脂肪因子vaspin可通过激活AMPK-mTOR通路上调并改善心肌缺血/再灌注过程中受损的自噬流;2.脂肪因子vaspin可通过激活心肌细胞自噬流,减少心肌细胞凋亡和氧化应激水平,进而减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤。