淀粉样前体蛋白(APP)的代谢是阿尔兹海默症(AD)发病机制的关键环节。一般认为,APP经蛋白酶剪切形成淀粉样蛋白(Aβ)的过程与AD发病密切相关。但Ap导致AD的具体机制还并不清楚。近年来的研究发现,Ap可能通过引起线粒体的功能紊乱而造成神经元的损伤,从而导致AD的发生发展。线粒体上的Ap可以由线粒体上的APP局部代谢产生,也可以摄取自线粒体外。蓄积于线粒体的Ap直接降低线粒体呼吸链上的细胞色素c氧化酶(COX Ⅳ)的水平与活性,损伤呼吸链的电子传递功能,增加活性氧(ROS)的产生,同时减少ATP的生成。由此引起的线粒体功能紊乱将在多个方面影响神经元的功能状态。阻断Aβ对线粒体功能的损伤,从而恢复线粒体的功能,可能有助于缓解或逆转AD的病理过程。芬乐胺(FLZ)是全合成的番荔枝酰胺衍生物。本课题在前期研究的基础上进一步研究FLZ的神经保护机制,分为三个部分。第一部分研究FLZ对线粒体上APP代谢过程的影响,由此产生的线粒体保护作用以及作用机制；第二部分研究FLZ对γ-分泌酶的选择性抑制作用；第三部分对由APPSwe造成的线粒体功能障碍对脑源性神经营养因子(BDNF)轴突转运功能的影响进行了初步研究。第一部分FLZ对线粒体上APP代谢过程影响的研究是在稳定过表达APP695(wt/Swe)的SH-SY5Y细胞(APP-SH-SY5Y)中进行的。FLZ可减缓APP在线粒体上的代谢,并减少线粒体上Aβ的生成。同时,FLZ改善线粒体功能,上调COXⅣ的蛋白水平和活性,增加ATP的生成。机制研究发现,FLZ降低γ-分泌酶活性中心早老素(PS)成熟的C端片段水平。FLZ可能通过抑制参与APP代谢的γ-分泌酶来减缓APP在线粒体上的代谢。在APP-SH-SY5Y细胞中的研究发现,FLZ对γ-分泌酶活性的抑制不同于γ-分泌酶活性的非选择性抑制剂DAPT,并没有减少Notch信号的胞内段(NICD)的产生。γ-分泌酶存在多种代谢底物,APP和Notch信号相关蛋白是其最主要的代表。选择性抑制γ-分泌酶的活性是抗AD药物研发中面临的一大挑战。为了进一步研究FLZ对γ-分泌酶抑制的机制,在第二部分的研究中使用APP的C端片段重组蛋白和NICD重组蛋白构建了γ-分泌酶活性检测平台。在体外γ-分泌酶活性检测体系中,FLZ剂量依赖性地抑制了APP的C端重组蛋白片段的代谢,而对NICD的代谢没有明显的剂量依赖性作用。DAPT(?)APP的C端重组蛋白和NICD重组蛋白代谢均呈明显的剂量依赖性抑制。上述研究结果提示FLZ是一种不同于DAPT的γ-分泌酶选择性抑制剂,可能通过选择性地抑制γ-分泌酶来减少线粒体上Aβ的蓄积。在本实验室前期的研究中发现,FLZ能够上调AD疾病模型中BDNF相关的信号活动。BDNF与神经元轴突末端的TrkB受体结合,内化后通过轴突逆向转运至胞体,调节相关基因的表达。神经元的轴突转运于线粒体的功能状态密切相关。因此,本课题第三部分对APPSwe相关的BDNF轴突转运障碍进行了的初步研究,考察线粒体的功能改善是否会促进BDNF的轴突转运。这部分研究使用慢病毒在原代海马细胞导入APPSwe,并重组表达带荧光标签的BDNF。感染了APPSwe慢病毒的原代海马细胞中,BDNF的进入量明显减少,同时线粒体分布面积减少,聚集于神经元胞体的细胞核周围。APPSwe可能通过损伤线粒体的功能,从而影响了神经元中BDNF的轴突转运。本课题的研究认为FLZ是一种有潜力的抗AD候选化合物,其机制可能是通过选择性地抑制γ-分泌酶从而减少线粒体上Aβ的生成,减少ROS,增加ATP的产生,改善线粒体的功能状态,发挥神经元保护作用。此外,在APPSwe相关的BDNF轴突转运障碍的初步研究中发现,APPSwe减弱了BDNF的轴突转运,其机制可能是损伤了线粒体的功能。本课题的创新点如下：1.建立了检测线粒体上Aβ的方法,使得对APP的线粒体代谢研究和Ap的线粒体损伤研究更为深入；2.建立了γ-分泌酶活性检测平台,有利于评价化合物对γ-分泌酶的选择性抑制作用；3.建立了在原代海马神经元中导入APPSwe的方法,为相关的抗AD药物研究提供了技术平台；4.获得了能够被神经元摄取的带标签的重组BDNF,有利于进一步的BDNF作用机制研究；