微卫星序列作为研究物种进化的重要工具已经越来越被人们重视,许多串联重复序列在基因组中具有重要的功能,目前普遍认为具有3个作用:一是组成开放阅读框的一部分:二是参与基因组的调节活动,(GA)n/(CT)n位于基因的启动子区域,是基因表达调节机制中的一个重要组成部分:三是组成染色体的脆性位点。基因组是一个复杂的信息储存系统在基因组系统结构中,重复序列作为主要的决定因素影响着DNA复制、染色体分离、基因表达等重要生命活动。对串联重复序列生物功能的研究还处于起步阶段,鉴于微卫星序列在基因组中的重要作用,有必要对微卫星序列的进化以及生物学功能进行深入地研究。大量的研究结果表明微卫星DNA(SSR)在物种多态性检测方面具有其独特优势,已广泛应用于生物遗传多样性研究、亲缘关系分析、品种鉴定、指纹图谱构建、主要性状基因的定位、遗传图谱及系谱分析和分子标记辅助选择育种等多个方面。尽管SSR的应用前景非常广阔,但从基因组文库中开发某一物种SSR标记是非常昂贵和费时的,因为它要求从已知的序列中开发合适的多态性信息位点,这一点不同于其它分子标记。上个世纪90年代人们就提出某一物种的开发出来的微卫星引物能否在其他相近物种中转移使用,研究发现微卫星DNA的侧翼序列比较保守,某一物种的微卫星引物可在相近物种中使用,这可以减少获取微卫星的工作量。在小麦族中前人成功的将小麦微卫星引物应用于黑麦、簇毛麦、山羊草等物种的研究中。这种简单有效的方法增加了相关物种的微卫星引物数量,通过这种方法还可以获得更多的种属特异分子标记。这样便可以为近缘物种的研究节约大量的成本。有利于探明近缘物种间的遗传同源性以及物种起源等生命科学领域中的重要问题。本研究利用小麦微卫星引物对小麦近缘属中遗传多样性,特异分子标记,以及近缘属中的微卫星序列的变异与进化进行了研究,得到如下主要研究结果:1.利用小麦微卫星DNA分析小麦近缘物种植物的遗传多样性利用218对小麦SSR引物对小麦及其近缘种共22个材料进行PCR扩增。从中筛选到39对多态性高、重复性好的引物,这些引物可在供试材料中检测出213个等位基因变异,平均每个位点可检测到5.4个等位基因。位点多态性信息量(PIC)变幅为0.38～0.89,平均为0.57。NTSYS软件的分析结果表明22份材料的遗传相似系数范围为0.46～0.94,平均遗传相似系数为0.67,聚类分析结果显示小麦、偃麦草、大赖草、黑麦均各自聚类,与传统的物种分类结果有较高的吻合度。这表明(1)SSR可以应用于小麦与其近缘种的遗传多样性研究。(2)SSR揭示的小麦与其近缘物种间的多态性高,可以用来鉴定小麦近缘种。2.发掘新的小麦与小麦近缘物种的特异分子标记本实验选位于普通小麦1A-7A、1B-7B、1D-7D染色体上的126对微卫星引物对普通小麦中国春、MY11、簇毛麦、粗山羊草、大赖草、偃麦草、黑麦七个材料进行了PCR扩增,结果发现有12个引物可以在黑麦中扩增出特异带来,8个引物可以在簇毛麦中扩增出特异带来,山羊草有4个,大赖草有9个,偃麦草有10个,其中大多数片段大小在500bp左右。本实验着重对黑麦的两个特异性标记进行了分离和鉴定,(1)发现引物对Xgwm260在黑麦中扩增出了一条长大约1000bp的黑麦特异片段,而供试品种小麦及其近缘属物种均未扩增出该片段,进而用该引物对小麦黑麦杂交F1代以及小麦—黑麦双二倍体进行扩增,结果显示所有含黑麦染色质的材料都能扩增出目标片段。为了确定该特异性标记在黑麦染色体组上的分布,我们利用引物Xgwm260对一套中国春-帝国黑麦二体附加系(1R-7R)进行扩增,在1R-7R附加系中,仅有4R染色体能出该片段,这表明该标记为黑麦4R染色体特有,可以应用于小麦背景中黑麦4R染色质的鉴定。对目标片段进行回收、克隆后进行序列测定,得到该片段的全长序列为988bp,命名为PMD260-1000。序列分析结果表明序列中941位CACTA转座子与转录因子SP1结合,378—383有GC框,并且GC框上有SP1,序列倒位重复,并含有开放阅读框,推断该序列结构可能为反转录转座子。(2)引物Xgwm232在黑麦中扩增出一条491bp的特异带,用上述同样的方法证明其特异性,并且将其定位在6R染色上,测序结果发现序列含有两个TATAA框。同时,将上述两个序列在NCBI比对都没有同源性高的序列,说明这两个序列为新的特异片段。3.通过分析序列研究小麦微卫星序列的变异与进化本实验在小麦近缘物种中克隆测定了一些特异重复序列,将测序结果输入NCBI的GENEBANK里进行同源性比对,并用DNAMAN软件分析序列结构,用来研究这些片段在漫长的进化过程中发生的变异。发现这些重复序列中含有多个与转录调控有关的保守序列以及与转录因子结合位点相似的核苷酸序列。尽管已有新蠡蚝诼筇匾斓闹馗葱蛄斜环掷氤隼?但仍有大量重复序列等待发掘。本文进一步发掘新的特异重复序列,阐明特异重复序列在小麦族植物中的分布与进化规律。(1)序列PMD-268与四倍体栽培小麦Triticum turgidum L.Langdon一致性达到97%.在进化过程中该序列的TATA框发生了突变,与这部分基因组序列的差异主要存在于重复序列的侧翼序列,这就使引物结合区发生了变异,导致在所有供试四倍体小麦中未能扩出。另外发现该序列与双倍体小麦(Triticummonococcum)actin gene(AF326781.1)与六倍体栽培小麦Triticum aestivumcultivar Renan clone BAC 930H14中部分核苷酸序列的一致性达到100%,35-66位核苷酸序列含有TATA框并且与一致序列TATAWAW(氨基酸序列)相对应,该序列可能与转录的起始有关。(2)PMD120-500序列为倒位重复,序列上下有各含有一个TATAA框,1是启动子的特征性序列。3′侧翼区序列含有一个特征性的加尾信号序列AATAAA,符合终止子的序列特征。该序列与小麦醇溶蛋白基因G2656gamma-gliadin gene中的核苷酸序列位5941—6306有高达91%的同源性,其中有两个AATAAA框发生了突变,进化过程中终止子突变可是由于碱基的突变、插人或缺失,有可能对调控元件之间的空间结构产生影响。与大麦属Hordeumvulgare subsp.vulgare eIF4E gene locus转录起始因子核苷酸序列的112712-113159位有高达91%的同源性,并且AATAAA框也发生了突变,黑麦的AATAAA框中插入了一个碱基G导致大麦的缺失该调控元件。