单基因病是指受一对主基因影响而发生的遗传病,在家系中遗传符合孟德尔定律,所以也称孟德尔遗传病。人类在线孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)数据库中,迄今为止有4368种遗传病的致病基因已被阐明,1669种疾病定位了致病区域但致病基因未明确,此外还有相当数量有着孟德尔特征的疾病仅对表型进行了描述,尚未进行致病基因定位。因此,充分挖掘人类单基因病遗传资源,将有助于进一步了解疾病,也为认识基因与疾病之间的关系提供依据。先天性并指(趾)畸形(Syndactyly,SD)主要临床特征为指(趾)间骨性或软组织融合,可单独发生,也可作为某种综合征的伴随表型。目前,根据并指/趾受累部位、数目及手/足骨异常等解剖学特征,非综合征型并指/趾可分为9个类型(I-IX),每类型下面又存在多种亚型,研究人员开展大量遗传学研究鉴定了多个类型并指(趾)畸形的疾病位点及致病基因,但仍然有部分类型疾病位点及致病基因尚不明确。目前,I型SD有四个亚型,I-a及I-b型致病基因分别定位于3p21.31及2q34-q36,但致病基因未明确。I-c型及I-d型仅对表型进行描述,致病区域及致病基因均未知;II型SD也称为并指(趾)多指(趾)畸形(synpolydactyly,SPD),有三个亚型。SPD1,SPD2致病基因分别为HOXD13和FBLN1,而SPD3定位于14q11.2-q13,致病基因未明确;III型、IV型、V型致病基因分别为GJA1、ZRS及HOXD13;VI型仅有表型描述,致病区域及致病基因均未知;VII型有2个亚型,VII-a及VII-b致病基因分别为LRP4及GREM1-FMN1;VIII型分两亚型,仅对表型描述,致病区域及致病基因均未知;IX型致病基因已被定位于17p13.3,但是致病基因尚未明确。以上类型VII-a及IX型属常染色体隐性遗传,VIII-a型可能为X连锁隐性遗传,而其它类型并指(趾)畸形均属于常染色体显性遗传方式。先天性厚甲症(Pachyonychia Congenita,PC)为一类罕见的外胚叶缺陷引起的遗传性疾病,主要遗传方式为常染色体显性遗传,以指(趾)甲增厚,过度角化,甲营养不良为主要临床特征,同时可伴有其它外胚叶发育不良的表现,如掌跖角化、角质松解、口腔咽喉部黏膜角化斑、毛发稀疏等。目前报道的致病基因有KRT6A、KRT16、KRT6B及KRT17,但仍有部分PC患者通过突变筛查未找到致病突变,该现象进一步提示PC可能存在新的致病变异形式或致病基因。根据致病基因筛查结果可将PC分为PC-16,PC-6a,PC-17,PC-6b及PC-U型(U代表未筛查到致病突变)。先天性并指(趾)畸形及先天性厚甲症两类疾病均属于肢端畸形相关疾病,可对患者生活造成严重影响。本研究以五个先天性肢端畸形家系为研究对象(两个I-c型并指家系,一个IV型并指家系及两个先天性厚甲症家系),针对不同疾病家系进行致病基因定位、突变鉴定及功能分析等系列研究工作。其中,对于I-c型并指畸形,OMIM数据库中仅有表型的描述尚未进行致病基因定位及研究,而IV型并指及先天性厚甲症已有相关致病基因报道,但存在突变筛查阴性患者,可能还存在新的致病变异形式或致病基因。对以上疾病开展研究,不仅能明确患者致病基因,致病突变及其功能影响,还能丰富疾病表型谱和突变谱,为研究疾病表型-基因的关系以及致病机制提供理论依据,也对遗传咨询、基因诊断等临床遗传学服务具有重要运用价值。本课题的主要研究内容和结果如下:1、I-c型并指(趾)家系致病基因定位及功能研究本部分研究家系A及家系B成员临床特征表现为3-4指并指,不伴有多指及足部畸形,与OMIM数据库中I-c型描述表型相符,该型并指(趾)畸形疾病位点及致病基因均不明确。基于家系开展了基因定位、突变鉴定及致病突变功能分析,旨在明确致病基因及致病突变,同时为并指/趾畸形机制的探索提供科学依据,主要研究结果如下:(1)致病基因定位:对五代74人家系A中28位成员(含17位患者)采用ABI连锁分析试剂盒进行STR分型,共涉及30个STR遗传标记覆盖整条2号染色体;LINKAGE软件包计算疾病位点与遗传标记的LOD值发现D2S335标记处LOD值最大(4.88,θ=0),证实了疾病位点与该标记紧密连锁;选取D2S335附近多态性高的遗传标记构建单体型进一步缩小致病区域,单体型分析结果提示D2S335,D2S2981,D2S2314和D2S324四个遗传标记与疾病共分离;同时还排除了I型SD已经报道的3p21.31及2q34-q36区域;以上结果在家系B(三代11人家系含7名患者)中得到验证,从而将I-c型并指致病基因定位于2q31-32;(2)致病基因及致病突变鉴定:区域候选基因测序发现家系A中所有患者携带有HOXD13基因c.917G>A杂合突变,该突变导致第306位密码子由CGG突变为CAG,氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺;家系B所有患者携带HOXD13基因c.916C>G杂合突变,该突变导致第306位密码子CGG突变为GGG,氨基酸由精氨酸突变为了甘氨酸,以上突变在健康对照及SNP数据库中均未检出。此外,对家系A中2位成员(正常及受累个体各1位)采用array-CGH排除了该区域可能存在的微缺失/重复变异。从而确定了I-c型SD致病基因为HOXD13,以及家系致病突变c.917G>A(p.R306Q)和c.916C>G(p.R306G);(3)致病突变功能初步研究:同源比对分析发现HOXD13基因第306位密码子碱基及其编码的氨基酸在物种间高度保守,Poly Phen-2及SIFTS分析提示家系致病突变“具有危害性”。构建HOXD13野生型及306Q及306G突变型表达载体,同时构建含有EPHA7启动子的PGL3-basic报告基因载体PGL3-basic-EPHA7 promotor。双荧光素酶报告基因提示致病突变可降低HOXD13对靶基因的转录激活能力,与野生型蛋白相比,306Q突变型降低38%,而306G突变型降低约40%,降低程度与已报道阳性对照I322L突变型蛋白相当(降低约42%);(4)HOXD13基因型-表型分析:HOXD13突变热点为多聚Ala及同源结构域homeodomain区。HOXD13突变引起的疾病表型异质性强,可引起短指畸形,I-c型SD,SPD1,V型SD及短指-并趾综合征等疾病,但表型变异具有一定的连续性。从I-c型SD表型(单侧3-4指受累,双侧3-4指受累),过渡到SPD1型表型(双侧3-4指受累叠加3-4指蹼间多指骨,双侧3-4指并指多指,双侧3-4指并指多指叠加了4-5趾并趾,双侧3-4指并指多指叠加了4-5趾并多趾),最后过渡到叠加掌跖骨异常的V型SD表型。此外,不同家系中或者家系不同成员间的表型存在重叠交叉现象。本部分研究首次报道I-c型并指致病基因为HOXD13。家系中发现的致病突变c.917G>A(p.R306Q)及c.916C>G(p.R306G)位于homeodomain区,突变可以影响HOXD13蛋白对下游靶基因的转录激活能力。以上研究结果扩展了HOXD13基因的疾病谱、突变谱以及致病突变的功能认识,有助于进一步明确HOXD13基因及其所引起疾病的相互关系。2、IV型并指畸形家系致病基因鉴定及功能研究本部分研究家系为一个四人家系,有2位患者,其中一名临床特征为六指畸形且全部并指,手指内收弯曲形似水杯,为典型的IV型SD表型(SD4)。其母为变异表型三节指节拇指-并指多指综合征(Triphalangeal thumb–polysyndactyly syndrome,TPTPS),SD4及TPTPS致病机制均为7q36的ZRS区域拷贝数增多。基于家系开展了致病突变鉴定及功能研究,旨在明确致病变异并为并指/趾畸形机制的探索提供科学依据,主要研究结果如下:(1)表型分析:家系同时存在SD4、TPTPS、轴前多趾、轴后多趾多种表型,提示ZRS区拷贝数变异所引起的肢端畸形机制复杂;(2)拷贝数变异分析:荧光定量PCR发现患者ZRS区拷贝数目增加1.5倍,采用array-CGH证实变异染色体精确区域为Chr7:156,505,616-156,620,919,长度约115kb;(3)ZRS区基因型-表型分析:ZRS区点突变,小片段插入以及拷贝数变异均会引起肢端畸形。其中点突变最常见,畸形程度轻,拷贝数变异罕见同时畸形程度最严重,轻微表型到严重表型过渡具有一定的连续性,但是点突变位置,拷贝数变异长度与疾病轻重之间无明显对应关系。本部分研究证明了IV型SD与TPTPS致病机制具有遗传同质性,基因型-表型分析提示ZRS区轻微表型到严重表型的过渡具有一定的连续性。3、先天性厚甲症家系突变筛查及功能研究本部分研究家系F01及F02临床特征均为典型厚甲表型,F01同时伴有掌跖角化而F01伴有眼部及毛发异常,符合先天性厚甲症表型报道。基于家系开展突变筛查,致病突变功能研究及基因型-表现分析等系列研究工作,主要结果如下:(1)突变筛查:家系F01中所有患者及胎儿均携带有KRT16基因c.383T>C杂合突变,导致128位密码子CTG突变为CCG,编码氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸(p.Leu128Pro),该突变在健康对照及SNP数据库中均未检出。家系F02未检测到厚甲基因的致病突变;(2)致病突变功能预测:同源比对分析提示KRT16基因第128位密码子及其编码的氨基酸在物种间高度保守,Poly Phen-2及SIFTS预测突变蛋白p.Leu128Pro具有危害性;(3)突变蛋白二级结构预测:采用Swiss-Model对野生型及突变型蛋白二级结构进行预测分析,结果提示当128Leu突变为Pro后,正常的α螺旋结构变为类似颈环样结构的异常螺旋结构,进而影响蛋白高级结构的组装;(4)突变蛋白细胞形态学研究:构建KRT16-128Leu及KRT16-128Pro与绿色荧光蛋白EGFP融合表达载体,转染293FT细胞发现野生型融合蛋白荧光信号强且均匀,细胞形态为正常的梭形,而突变型融合蛋白荧光信号弱且弥散,细胞形态异常表现为多边形及圆形;(5)KRT16基因型-表型分析:KRT16基因高频突变位点为第125,127和132位密码子,约63%报道的PC-16型患者均属这三个位置的突变。部分突变氨基酸类别、位点与疾病的轻重程度有密切关系,第127和128位密码子突变为脯氨酸时患者伴有严重的掌跖角化现象。本部分研究在中国患者中鉴定了新突变c.383T>C(p.Leu128Pro),该突变可导致蛋白二级结构异常,影响到蛋白高级组装,进而影响到细胞正常形态。此外,先天性厚甲仍然存在筛查阴性的患者,该现象也进一步提示PC可能存在新的致病变异形式或致病基因。综上所述,本课题对I-c型并指,IV型并指及先天性厚甲症三种肢端畸形家系开展研究。首次明确了I-c型并指畸形致病基因为HOXD13,在三种疾病中均报道了致病基因的新突变,并且通过功能研究证实了致病突变的危害性,对基因型-表型的分析也进一步明确已报道突变与疾病间的初步关系。以上结果扩展了肢端畸形疾病的表型谱、突变谱以及致病突变的功能认识,为遗传咨询、基因诊断、产前诊断等临床遗传服务及疾病机制的进一步探索提供了理论依据。