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目的:研究灵芝多糖(GLP)有效组分经纳米化改造后相对于游离灵芝多糖对树突状细胞(DC)免疫调节活性的变化及与化疗药物阿霉素联用后的抗肿瘤效应。方法:1.将灵芝粗多糖先进行去除蛋白质和色素的预处理,然后通过DEAE-32纤维素阴离子交换层析与Sephacryl S-300凝胶过滤层析,对灵芝多糖组分进行分离纯化,对高纯度的有效组分(简称为GLP)的单糖组成及分子量进行分析测定;2.将GLP与巯基化试剂进行反应,并加入硼氢化钠得到带有末端巯基的多糖。然后,将巯基化多糖与氯金酸混合搅拌并加入硼氢化钠进行反应,得到灵芝多糖-金纳米复合物(GLP-Au);3.将GLP和GLP-Au进行系列表征研究,验证GLP是否跟金纳米颗粒形成稳定的共价结合;4.通过研究DC表面抗原分子(CD80、CD86、CD40、MHCII)的表达量、DC的内吞能力、DC内酸性磷酸酶(ACP)活力及DC的细胞因子表达情况,来比较GLP-Au和游离GLP对DC的免疫调节活性;5.通过由DC介导的T细胞增殖实验来间接评价纳米化的GLP-Au和游离GLP的免疫刺激作用;6.通过灵芝多糖的体内实验,初步探究GLP-Au和游离GLP对小鼠的免疫刺激作用大小;7.探究纳米化GLP-Au相比于游离GLP与化疗药物阿霉素(DOX)联用后对小鼠4T1乳腺癌皮下瘤生长抑制作用的变化。结果:经我们分离纯化得到具有免疫活性灵芝多糖组分GLP,以HPGPC法检测得到的分子量大小为15.1 KDa,采用气质联用(GC-MS)技术分析得到的GLP的单糖组分主要为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖,另外还有少量的木糖、鼠李糖和甘露糖。这六种单糖组分的比例为18.6:38.8:25.6:4.72:4.49:7.75。在透射电镜(TEM)下观察到我们制备的GLP-Au纳米颗粒大小分散均匀,检测得到的紫外、红外吸收光谱和X射线衍射图谱表明,在GLP-Au纳米颗粒中的GLP组分和Au金属粒子牢固紧密的结合在了一起。体外诱导分化制备的小鼠DC在经过不同浓度(10,20,40μg/ml)GLP-Au或GLP处理后,都能刺激DC表面抗原分子表达量的升高,且在相同多糖浓度下GLP-Au比GLP具有更强的刺激作用。GLP和GLP-Au都能降低DC的内吞能力,并且与游离GLP处理的细胞相比,经对应的各个浓度GLP-Au处理的DC的吞噬能力都比经游离GLP处理的DC的吞噬能力进一步降低。同样,采用10,20,40μg/ml的GLP或GLP-Au处理的DC中ACP活性都会降低,但经GLP-Au处理的DC中ACP活性比经GLP处理的DC中ACP活性可进一步降低。DC经GLP-Au刺激后其显著增强了IL-6,IL-12,IL-1β,TNF-α和IFN-γ的m RNA表达。与GLP相比,经GLP-Au刺激后的DC分泌细胞因子表达量显著强于经游离的GLP处理后的表达量。GLP-Au通过TLR4激活DC,并且DC对GLP-Au的内吞也是部分导致DC成熟的原因。相对于GLP,GLP-Au对DC介导的T细胞增殖有更强的免疫刺激作用。GLP-Au相比于GLP更有效的刺激正常小鼠体内免疫反应。灵芝多糖与DOX的联用对小鼠4T1乳腺癌皮下瘤起到了较好的抑制效果,不仅抑制了癌细胞的生长而且也抑制了癌细胞的肺转移,并且增加了荷瘤小鼠脾细胞中记忆CD4~+和CD44~+型T细胞的比例。结论:我们的结果显示体外GLP-Au能够比GLP诱导更强的DC活化(表型标记和功能)以及强大的T细胞应答(CD4/CD8~+T细胞增殖)。其次,联合治疗表明当与DOX联合治疗时,GLP-Au对肿瘤生长和转移的作用强于游离GLP。我们假设化学治疗药物如DOX可能会破坏少量肿瘤细胞,促进可被DC捕获的肿瘤抗原的释放。在肿瘤抗原呈递期间,GLP-Au促进共刺激因子如CD40/80/86和MHCII的表达,进而有效刺激T细胞应答(细胞增殖和功能改变)。最后,我们发现化疗药物可能通过降低CD4/CD8~+T淋巴细胞的百分比来损害免疫系统,而GLP-Au则逆转了CD4~+和CD8~+T细胞群的下降。此外,GLP-Au显著诱导记忆T细胞,这可能是有效抑制肿瘤转移的重要事实。结果表明,该研究为多糖纳米制剂的设计提供了基础,这种设计不仅促进了免疫活性多糖的稳定性和延长了其刺激作用,而且提出了一种降低化疗药物和多糖剂量的策略。临床上使用的其他经典多糖产品(例如香菇多糖或黄芪多糖)也可以配制成纳米复合材料,旨在将纳米技术应用于传统医学的现代化中。