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本实验室前期研究表明,经60%乙醇沉淀的硫酸酯化后的松花粉多糖(SPPM60)可以作用于小鼠脾脏混悬淋巴细胞,并且可以升高脾淋巴细胞[Ca2+]i;对小鼠淋巴细胞进行分离后,发现添加SPPM60同样可以作用于T、B淋巴细胞。马尾松花多糖水提物、醇提物以及甾醇均可作用于3T3-F442A前脂肪细胞,对脂肪细胞分化和脂质积累产生促进效应,并且马尾松花粉甾醇对脂肪细胞葡萄糖代谢以及AMPK和GLUT4的表达均产生抑制效应。目前,鲜有基于马尾松花粉多糖(PPM60)及酯化物(SPPM60)对3T3-F442A前脂肪细胞脂质分化以及胞内钙离子浓度作用的研究。因此,该研究将重点探究本实验纯化的松花粉多糖(PPM60-B)及其酯化物(SPPM60-B)对3T3-F442A前脂肪细胞增殖、脂质积累和[Ca2+]i等的影响;以及酯化多糖调控脂肪细胞内钙离子浓度,从而引起脂肪细胞内脂质积累改变的机制。实验主要分为以下几部分内容: 一、实验采用水煮醇沉法提取工艺提取马尾松花粉多糖,经三氯乙酸法除杂蛋白后,得到经多级醇沉和聚丙烯酰胺凝胶Sehpacryl S-400R纯化后的60%多糖组分,并命名为PPM60-B,经氯磺酸-吡啶法得到酯化多糖SPPM60-B。氯化钡-明胶比浊法计算多糖取代度并进行红外光谱表征后,验证多糖酯化成功。两种多糖可用于进行后续实验。 二、MTT法分别研究上述两种多糖在不同浓度和时间下对3T3-F442A前脂肪细胞增殖的影响。实验表明,作用前脂肪细胞24-72 h后,浓度为10μg/mL、25μg/mL和50μg/mL的SPPM60-B对前脂肪细胞增殖具有较为显著的抑制作用。当作用时间为48 h,浓度为10μg/mL的SPPM60-B对前脂肪细胞的抑制作用最强,抑制率可达到24.92%。而PPM60-B和其他浓度的SPPM60-B在不同作用时间段内,均表现出不同程度的促进前脂肪细胞增殖的效果。 三、将上述两种多糖在不同浓度下作用于3T3-F442A前脂肪细胞,通过油红O染色,镜下形态学观察前脂肪细胞分化情况,异丙醇半定量法和甘油三酯试剂盒检测前脂肪细胞分化水平。实验表明,PPM60-B对前脂肪细胞分化无显著性影响。而SPPM60-B则出现低浓度抑制分化,高浓度促进分化的效果。在浓度为10μg/mL时,SPPM60-B对前脂肪细胞分化有较为明显的抑制作用。 四、选取处于分化早期的3T3-F442A前脂肪细胞,双波长荧光法测定上述两种多糖引起的分化阶段脂肪细胞[Ca2+]i的变化。实验证实,PPM60-B对前脂肪细胞[Ca2+]i变化无显著性影响。SPPM60-B对前脂肪细胞[Ca2+]i增加有剂量依赖效果,表现为酯化多糖浓度越高,胞内[Ca2+]i越高。200μg/mL SPPM60-B作用效果最强,且作用效果最佳。选取200μg/mL SPPM60-B孵育细胞,并检测发现,各胞内钙离子通道抑制剂(LY294002、U73122、LMWH、2-APB和Verapamil)均能一定程度上抑制由SPPM60-B引起的3T3-F442A前脂肪细胞内[Ca2+]i升高。而低分子肝素(LMWH)和2-APB能完全抑制SPPM60-B所引起的3T3-F442A前脂肪细胞[Ca2+]i的升高,且抑制后[Ca2+]i低于空白对照组。 综上所述,本实验结果表明:松花粉硫酸酯化多糖可以通过调节胞内钙离子浓度从而对3T3-F442A前脂肪细胞增殖活性和脂质分化和积累产生影响。并且推测,其潜在的分子机制是通过receptor-PI3K-PLC-IP3R-Ca2+信号通路活化胞内内质网钙库IP3R通道,从而引起Ca2+的释放,而后激活膜表面CRAC通路,引起胞外钙离子内流,引起胞内钙离子浓度进一步升高。本实验对研究多糖调控前脂肪细胞脂质生成的机制有重要的意义。