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肿瘤是一种常见病、多发病,肿瘤现已上升为仅次于心血管病的第二号死亡病因。硫氧还蛋白还原酶和硫氧还蛋白具有多种生物学活性,可以调节机体的氧化还原、防御氮氧化应激、调节细胞生长与增殖,与肿瘤发生、发展密切相关。抑制硫氧还蛋白还原酶活性是治疗肿瘤的一个新思路。近年来,以硫氧还蛋白还原酶为靶点的抗肿瘤药物研究已成为了热门课题。目前国内外只发展出为数不多的硫氧还蛋白还原酶抑制剂,且部分抑制剂作用机理尚未阐明。寻找新型的天然或合成的硫氧还蛋白还原酶抑制剂具有重要的意义。
本研究发现了一系列姜黄素类似物和曼宋酮F类似物作为有效的硫氧还蛋白还原酶抑制剂,探讨了姜黄素类似物和曼宋酮F类似物与硫氧还蛋白还原酶的相互作用机制,并研究了曼宋酮F类似物对肿瘤细胞内硫氧还蛋白还原酶水平的影响及其与肿瘤细胞凋亡的关系。
本论文主要研究内容包括:
1.以硫氧还蛋白还原酶为靶点的抑制剂的研究进展。概述了硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶的结构特点、生物学功能及其与疾病的关系,以及以硫氧还蛋白还原酶为靶点的抑制剂研究进展。
2.硫氧还蛋白还原酶的制备及其特性研究。通过匀浆、硫酸铵盐析、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换色谱柱层析、BlueSepharoseCL6B亲和色谱柱层析、ResourceQ强离子交换色谱柱层析和Superdex200prepgrade凝胶过滤色谱柱层析等方法,从猪脑中分离并纯化出硫氧还蛋白还原酶,并对硫氧还蛋白还原酶进行了表征。
3.野生型硫氧还蛋白的制备。通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharosefastflow离子交换凝胶色谱柱层析和Superdex75prepgrade凝胶过滤色谱柱层析等方法,从重组的野生型硫氧还蛋白表达的大肠杆菌中分离并纯化出硫氧还蛋白。
4.姜黄素类化合物对硫氧还蛋白还原酶的抑制活性及其作用机理研究。研究了几个系列的对称结构的单酮姜黄素类似物作为有效的硫氧还蛋白还原酶抑制剂,并对构效关系进行了讨论。通过抑制模型实验和WesternBlotting实验,揭示了姜黄素类似物通过亲核反应以共价方式与硫氧还蛋白还原酶的C-端氧化还原活性中心Cys497和Sec498氨基酸残基发生不可逆结合。
5.曼宋酮F类似物对硫氧还蛋白还原酶的抑制活性及其抗肿瘤机理研究。研究了一系列合成的曼宋酮F类似物对硫氧还蛋白还原酶的抑制作用。使用不同底物研究了曼宋酮F类似物对硫氧还蛋白还原酶的抑制动力学模型,曼宋酮F类似物是硫氧还蛋白还原酶的线性混合型抑制剂。通过NADPH氧化实验、细胞色素c还原实验、SOD对细胞色素c还原的抑制实验证实了硫氧还蛋白还原酶催化还原曼宋酮F类似物的过程中,伴随着氧化还原循环,并有超氧阴离子自由基的产生。建立了曼宋酮F类似物与HeLa细胞的作用模型,通过细胞毒性测试实验、细胞内硫氧还蛋白还原酶活性测定实验、细胞内活性氧的检测、细胞周期分析、AnnexinV-FITC/PI荧光双标法等多种手段,证明了曼宋酮F类似物会使细胞周期阻滞在G1期,并且诱导HeLa细胞凋亡。此外,曼宋酮F类似物能降低细胞内的硫氧还蛋白还原酶活性,并且有活性氧产生。结果表明曼宋酮F类似物对硫氧还蛋白还原酶的抑制作用有可能是这类化合物抗肿瘤活性机制中的其中一种途径。