[目的]深静脉血栓(DVT)是骨科手术常见并发症,常导致严重后果,其机制复杂,需继续深入探索。近年来研究发现,血管内皮细胞(VEC)凋亡在DVT的发病机制中起着重要作用,而这一过程可能与microRNAs相关。研究表明microRNAs广泛参与调控细胞分化、增殖、凋亡等生理及病理生理过程,且miR-126是与VEC及血管功能密切相关的microRNA,提示miR-126可能参与了VEC凋亡的调控。此外,研究还显示,Bcl-2, Bad表达在不同组织及细胞凋亡的过程中存在差异性表达。因此,本实验在构建miR-126基因沉默/高表达的大鼠DVT模型后,采用HE染色、TUNEL细胞凋亡检测试验来观察miR-126表达变化对DVT形成及内皮细胞凋亡的影响。并通过Western bolt分析Bcl-2, Bad表达在不同组中的表达变化,探寻miR-126与DVT静脉内皮细胞凋亡及Bcl-2, Bad的相关性,为DVT防治新方法提供理论依据和新靶点。[材料和方法]1.分组及造模：将72只SD大鼠(250±20g),雌雄各半、年龄不限,随机分为4组。A、正常对照组(12只)：给予腹腔注射20ml生理盐水,不进行其他处理。B、DVT模型组(20只)：给予腹腔注射20ml生理盐水,四天后腹腔麻醉,腹正中线逐层开腹,分离暴露下腔静脉,5-0爱惜康缝合线沿下腔静脉平行、紧贴放置,再用4-0爱惜康缝合线结扎此处下腔静脉,再抽去并排的5-0爱惜康缝合线,关腹,正常饲养；C、miRNA-126沉默组(20只)：给予腹腔注射含400pmol antagomir的转染化合物20ml,构建miR-126基因沉默的大鼠模型,四天后处理同DVT模型组；D、miRNA-126高表达组(20只)：给予腹腔注射含400pmol agomir的转染化合物20ml,构建miR-126基因高表达的大鼠模型,四天后处理同DVT模型组；2、静脉壁采集及病理检查根据预实验结果,分别于造模后2h、24h随机抽取正常组、DVT模型组、miRNA-126沉默组、miRNA-126高表达组大鼠各半数,经麻醉消毒后开腹切取结扎线至髂总静脉分叉处之间2cm长的下腔静脉及其内容物,肉眼下观察是否有血栓形成,并将部分新鲜组织以4%多聚甲醛固定后送石蜡切片观察血栓形成状态,其余部分经生理盐水冲洗,去掉管内外血栓后迅速放人冻存管,置入液氨罐保存。3、采用TUNEL染色观察静脉内皮细胞凋亡情况从液氨罐中取出不同时间点位各组分组织快速作石蜡切片,并按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海翊圣)说明书操作检测静脉内皮细胞凋亡发生情况,经DAPI复染后在荧光显微镜下观察及拍摄。4、Western bolt检测SD大鼠DVT静脉壁组织中Bcl-2, Bad的蛋白表达变化A、使用组织裂解液对不同时间位点保存于液氮中的各组静脉壁材料进行总蛋白的提取并用BCA法测定总蛋白浓度。B、制备SDS-PAGE电泳后进行转膜、封闭、抗体孵育等操作；以ChemiScop Series3600化学发光成像系统拍照显示结果,并用Chemi Analysis分析计算灰度值。C、选用SPSS17.0统计软件包进行数据处理,各组数值用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA);各组结果以P<0.05为有统计学意义。[结果]1、肉眼观察血栓形成情况2h位点,大鼠DVT组、沉默组及高表达组肉眼观可见有静脉管壁水肿,颜色加深,未见明显血栓形成；在24h位点,除正常组外,其余三组静脉管壁明显水肿,下腔静脉明显肿胀及青紫,内有大量血栓形成,并以DVT模型组及miRNA-126沉默组最明显。2、HE染色观察血栓形成情况2h位点,各组大鼠HE染色无明显血栓形成,但DVT模型组及miRNA-126沉默可见多量红细胞集聚,在24h时可见DVT组及miRNA-126沉默组完全血栓形成,miRNA-126高表达组不完全性血栓形成。3、Tunel凋亡实验在不同时间位点,通过观察荧光密度(即细胞凋亡程度)判断细胞凋亡情况；在2h时,miR-126沉默组内皮细胞细胞凋亡情况较DVT模型组重,而正常组及miR-126高表达组未看到明显细胞凋亡；至24h,除正常组外均可见内皮细胞凋亡发生。与DVT模型组相比,miR-126沉默组凋亡程度重,miR-126过表达组,细胞凋亡程度较轻。4、Western bolt检测Bcl-2, Bad蛋白与正常组相比,各组Bel-2、Bad表达水平在不同时间位点发生了改变。结合统计学分析,在2h,Bcl-2表达组内不全相等(F=2982.881,p<0.001),有统计学差异,在24h位点,Bcl-2组内不全相等(F=352.747,p<0.001),有统计学意义,在2h、24h位点,DVT组与miRNA高表达组、miRNA沉默组与miRNA高表达组差异明显(P<0.001)；在2h位点,Bad表达组内不全相等(F=571.01,p<0.001)有统计学差异,在24h位点,Bad组内不全相等(F=393.684,p<0.001),有统计学意义,在2h、24h位点,DVT组与miRNA高表达组、miRNA沉默组与miRNA高表达组Bad表达差异明显(P<0.001)。[结论]l、miR-126与DVT形成及静脉内皮细胞凋亡呈负相关2、miR-126与Bcl-2表达水平呈正相关,与Bad表达水平呈负相关