动脉粥样硬化性疾病在全球罹患率与致死率均名列前茅，严重危害人类健康。其早期病变的标志性特征为血管内皮下大量巨噬细胞内脂质蓄积和泡沫细胞的形成。泡沫细胞最终坏死崩解释放出胞内的胆固醇，构成动脉粥样硬化斑块的主要成分，进一步促进动脉粥样硬化的进展。因此，促进巨噬细胞内胆固醇流出及体内胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)，从而抑制泡沫细胞形成和血管壁内脂质沉积对动脉粥样硬化性疾病的防治具有重要意义。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)为膜整合蛋白，以ATP为能源将胞内游离胆固醇和磷脂转运到胞膜，最终与附在细胞表面的载脂蛋白AI (apoprotein AI，apoAI)结合。这一过程为高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）生成所必需，也是促进巨噬细胞内过量胆固醇流出及RCT的关键步骤。ABCA1在巨噬细胞中的表达和活性受到转录和转录后水平的严密调控。microRNA是一类内生性的、长约22个碱基的小分子RNA，在转录后水平调控基因表达。microRNA通过碱基互补配对与靶基因的3’非翻译区（3’untranslatedregion，3’UTR）结合，从而导致靶基因mRNA降解和翻译抑制。文献报道miR-19b与胞内脂质代谢密切相关。高脂饮食可诱导miR-19b表达上调，在人主动脉粥样硬化斑块及腹主动脉瘤中检测到miR-19b高表达，提示miR-19b在动脉粥样硬化发生发展中发挥重要作用，但miR-19b致动脉粥样硬化的相关作用机制尚不清楚。为了探讨miR-19b致动脉粥样硬化的相关作用机制，前期采用生物信息学预测miR-19b的靶基因，发现miR-19b恰好具有靶向调控ABCA1的生物学理论基础。据此设想，miR-19b靶向作用巨噬细胞ABCA1的表达，抑制胞内胆固醇流出和RCT，促进胞内脂质蓄积和血管壁脂质沉积，从而导致动脉粥样硬化的发生发展。为了验证miR-19b致动脉粥样硬化机制的这一假说，我们首先在第一部分实验中对miR-19b靶向作用ABCA1进行了深入的生物信息学分析，并用荧光素酶报告基因验证了miR-19b结合ABCA13’UTR，然后，在第二部分实验中我们研究了miR-19b对巨噬细胞ABCA1表达、胞内胆固醇流出及脂质含量的影响，接着，在第三部分实验中，我们观察了miR-19b对apoE-/-小鼠的RCT、血脂水平及动脉粥样硬化病变的影响，最后，在第四部分实验中，我们观察了具有明显调脂作用的薯蓣皂苷元（Diosgenin，Dgn）对巨噬细胞miR-19b水平、ABCA1表达、脂质代谢及apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的影响，探讨了Dgn通过抑制miR-19b抗动脉粥样硬化的作用机制。本研究揭示了miR-19b在动脉粥样硬化发生发展的作用及其机制，为动脉粥样硬化性疾病的防治提供新的干预靶点。第一部分miR-19b靶基因的预测及其与巨噬细胞ABCA13’UTR的靶向作用目的：预测miR-19b与靶基因ABCA1的靶向结合及结合位点和自由能情况，在细胞水平验证miR-19b是否与ABCA13’UTR靶向结合。方法：从miRNAbase数据库获取成熟的miR-19b序列，从GeneBank查询ABCA13’UTR序列。利用miRDB、miRanda、miRNA Viewer、TargetScan和RNAhybrid在线数据库预测分析人/鼠miR-19b与ABCA1的结合情况、结合位点及结合自由能情况。根据预测结果，用PCR方法扩增人THP-1巨噬细胞ABCA13’UTR，构建野生型psiCHECK-2-ABCA1-WT3’UTR、突变型psiCHECK-2-ABCA1-Mut3’UTR和miR-19b mimic共转染到293T细胞，检测荧光素酶报告基因的活性和ABCA13’UTR序列的mRNA水平变化。结果：在成功获取miR-19b成熟序列和ABCA13’UTR序列基础上，生物信息学分析发现人/鼠ABCA13’UTR中存在多个结合位点，miR-19b与ABCA1的结合评分较高，且二者结合的自由能较低。 miR-19b mimic与野生型psiCHECK-2-ABCA1-WT3’UTR共转染后抑制荧光素酶活性和ABCA13’UTR序列的mRNA水平，与突变型psiCHECK-2-ABCA1-Mut3’UTR共转染后荧光素酶活性和ABCA13’UTR序列的mRNA水平无变化。结论：miR-19b具有靶向作用人/鼠ABCA1的生物信息学基础，能够结合人巨噬细胞ABCA13’UTR。第二部分miR-19b靶向沉默人/鼠巨噬细胞ABCA1表达对胆固醇流出的影响目的：观察对miR-19b对人/鼠巨噬细胞ABCA1蛋白及mRNA表达水平、胞内胆固醇流出和脂质含量的影响。方法：培养人THP-1巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞（mouse peritonealmacrophage，MPM），利用RiboFECTTMCP转染试剂，将miR-19b mimic或miR-19binhibitor转染到THP-1巨噬细胞/MPM中，实时荧光定量PCR和western blot检测ABCA1mRNA和蛋白表达；液体闪烁计数测定荷脂THP-1巨噬细胞/MPM细胞内胆固醇流出情况，HPLC检测胞内脂质含量；油红O染色显示胞内脂滴情况。结果：转染miR-19b mimic的THP-1巨噬细胞/MPM中ABCA1mRNA和蛋白水平明显下调，胞内胆固醇流出减少，胞内总胆固醇（total cholesterol，TC）、胆固醇酯（cholesterol ester，CE）及游离胆固醇（free cholesterol，FC）的含量明显增加，胞内脂滴稠密且体积肥大，而转染miR-19b inhibitor则刚好出现相反的结果。结论：（1）miR-19b具有靶向抑制THP-1巨噬细胞/MPM中ABCA1mRNA和蛋白表达的作用。（2）miR-19b具有调控THP-1巨噬细胞/MPM胆固醇流出的功能，其机制可能与靶向调控ABCA1有关。第三部分miR-19b对apoE-/-小鼠胆固醇逆向转运、动脉壁脂质沉积和粥样硬化病变的影响目的：探讨miR-19b对apoE-/-小鼠体内RCT、血脂水平、主动脉壁脂质沉积和粥样硬化病变的影响及机制。方法：高脂饮食（含15%猪油+0.25%胆固醇）喂养的45只apoE-/-小鼠，随机分为3组：高脂对照组、miR-19b agomir组、miR-19b antagomir组。液体闪烁计数测定MPM来源的RCT效率；酶氧化法检测甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）等血脂水平；苏丹Ⅳ染色显示主动脉内膜的动脉粥样硬化病变情况；HE染色显示主动脉窦动脉粥样硬化病变情况；油红O染色观察主动脉窦处脂质沉积情况；Masson三色染色显示斑块中的胶原纤维；western blot检测小鼠主动脉ABCA1蛋白表达。结果：转染miR-19b agomir明显抑制apoE-/-小鼠粪便中3H固醇的放射活性，降低血浆HDL-c水平，升高LDL-c水平，增加主动脉内膜的动脉粥样硬化病变面积，加剧主动脉窦处脂质沉积，降低斑块的稳定性，下调主动脉ABCA1蛋白表达。转染miR-19b antagomir则明显增加粪便中的固醇水平，改善血脂水平，抑制主动脉壁内脂质沉积和动脉粥样硬化病变的进展，上调ABCA1蛋白表达。结论：（1）miR-19b损害apoE-/-小鼠体内RCT，促进血管壁内的脂质沉积和动脉粥样硬化的进展。（2）miR-19b的致动脉粥样硬化效应可能与靶向抑制apoE-/-小鼠主动脉ABCA1表达有关。第四部分薯蓣皂苷元对miR-19b/ABCA1水平及apoE-/-小鼠主动脉病变的影响目的：观察薯蓣皂苷元（Diosgenin，Dgn）对THP-1巨噬细胞/MPM中miR-19b与ABCA1水平及其对apoE-/-小鼠体内RCT、血脂水平、主动脉壁粥样硬化病变的影响，从而探讨Dgn抗动脉粥样硬化的作用机制。方法：用Dgn处理并结合miR-19b mimic或inhibitor转染THP-1巨噬细胞/MPM后，实时荧光定量PCR检测miR-19b水平，western blot检测ABCA1蛋白表达；液体闪烁计数测定荷脂THP-1巨噬细胞/MPM细胞内胆固醇流出情况，HPLC检测胞内脂质含量。将高脂饮食（含15%猪油+0.25%胆固醇）喂养的60只apoE-/-小鼠随机分为4组：高脂对照组、薯蓣皂苷元组、薯蓣皂苷元+miR-19bagomir组、薯蓣皂苷元+miR-19b antagomir组。液体闪烁计数测定MPM来源的RCT效率；酶氧化法检测TG、TC、HDL-c和LDL-c等血脂水平；HE染色显示主动脉窦动脉粥样硬化病变情况；油红O染色观察主动脉窦处脂质沉积情况；Masson三色染色显示斑块中的胶原纤维。结果：Dgn呈剂量和时间依赖性上调THP-1巨噬细胞/MPM中ABCA1蛋白表达，明显降低miR-19b水平，增加胞内胆固醇流出，减少胞内TC、CE及FC的含量。Dgn增加apoE-/-小鼠粪便中3H固醇的放射活性，升高血浆HDL-c水平，降低LDL-c水平，上调主动脉ABCA1表达，减少主动脉内膜的动脉粥样硬化病变面积，减轻主动脉窦处脂质沉积，增加斑块的稳定性。miR-19b拮抗Dgn的上述效应，抑制miR-19b则增强Dgn的上述效应。结论：（1）Dgn抗动脉粥样硬化作用与促进巨噬细胞内胆固醇流出和体内RCT的功能有关。（2）Dgn抗动脉粥样硬化的作用机制与下调miR-19b从而促进ABCA1表达有关。