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百日咳是由百日咳鲍特氏菌(以下简称百日咳杆菌)引起的一种呼吸道传染病,在婴幼儿当中较为常见。百日咳杆菌致病机理包括粘附、侵袭、产毒等一系列的过程。丝状血凝素(Filamentous hemagglutmin)、粘附素(Pertactin)、百日咳气管定植因子(Tracheal colonization factor; TcfA)等诸多膜表面蛋白参与到细菌的粘附过程。百日咳气管定植因子是百日咳杆菌膜表面蛋白,相关文献报道,推测该蛋白可能是百日咳杆菌的粘附分子,但对其粘附功能尚未进行系统的验证。因此本研究采用DNA重组技术,在大肠杆菌(BL21;DE3)内表达TcfA蛋白,并纯化重组TcfA蛋白。然后通过重组表达菌的体外细胞粘附实验、重组蛋白免疫荧光实验、竞争抑制实验证明TcfA蛋白的黏附作用。并在此基础上,就TcfA蛋白第317-319位RGD三联肽的功能进行验证。同时通过构建FHA-PRN-基因缺失株,探究TcfA蛋白在粘附过程中的重要性,并尝试找出TcfA蛋白与经典模型细胞HeLa相互作用的受体。通过基因重组技术成功的表达了TcfA蛋白,并纯化出纯度达85%的重组蛋白,免疫印迹实验结果显示,重组蛋白能与疫苗生产菌株(CS菌)全菌体血清发生抗原抗体反应,说明重组蛋白具有良好的免疫反应性和抗原特异性;玻片凝集实验和V管凝集实验证明TcfA蛋白表达于大肠杆菌膜表面;荧光粘附试验证实表达有TcfA的大肠杆菌与含有空载体的大肠杆菌对经典模式细胞的粘附有明显的差异,CFU实验定量证实两者之间具有统计学差异。粘附ELISA实验从另一技术方法反映了两者之间具有统计学差异。重组蛋白的免疫荧光实验间接反映了TcfA蛋白与细胞受体的相互作用,重组蛋白的竞争抑制实验表明TcfA蛋白能竞争抑制重组TcfA大肠杆菌的粘附,并表现出蛋白浓度的依赖性。TcfA小鼠多抗封闭实验结果显示,封闭了重组大肠杆菌膜表面的TcfA蛋白,细菌的粘附率出现明显的下降,说明了TcfA蛋白的粘附的特异性(依赖性)。含RGD的短肽与含RGE的短肽的竞争抑制试验表明,TcfA蛋白可能通过其氨基酸位点上的RGD模序发挥作用。庆大霉素胞外杀伤实验是检测病原菌是否具有入侵宿主细胞能力的有效方法之一,该方法主要是检测粘附分子是否介导了病原菌的入侵。实验结果显示,TcfA蛋白并不介导重组大肠杆菌入侵HeLa细胞。FHA、PRN基因缺失株与抗TcfA小鼠多克隆抗体作用后,粘附力相比于FHA、PRN基因缺失株和CS野生株有较明显的下降,说明TcfA蛋白作为百日咳杆菌膜表面的一个粘附因子,在细菌的粘附过程中发挥着重要的作用。GST pull down实验初步证明Myosin-9蛋白可能是TcfA蛋白与HeLa细胞相互作用的受体,但需要进一步验证。