由新月弯孢霉[Curvularia lunata(Wakker)Boed.]引起的玉米弯孢叶斑病是一种世界性玉米病害,引起该病的病原菌存在明显的致病性分化现象,导致品种抗病性丧失。本研究利用抗性寄主连续诱导玉米弯孢叶斑病菌发生致病性变化,研究致病性变化的动态过程,分析病原菌致病性对抗性种质选择压力的敏感程度,揭示致病性变化的分子基础,为热带和亚热带抗性种质资源长期不合理使用可能引起的病菌适应性变异提供理论基础和风险预警。本文对玉米新月弯孢霉CX-3菌株进行了全基因组序列测定和分析;比较了不同抗性玉米种质对病原菌致病性选择的影响;通过蛋白质组学、转录组学等途径,分析了毒性强弱菌株基因表达差异;遗传学途径分析了一些与致病性有关的基因功能。主要研究内容和结果如下:1、基因组测序及序列分析。首先,对C.lunata CX-3全基因组进行测序,对测序数据进行拼接组装。其次,进行基因预测和基因家族聚类,筛选致病相关基因;最后,进行比较基因组分析。结果显示:(1)C.lunata CX-3基因组组装大小为35.5 Mb,编码11234个蛋白,其中分泌蛋白840个;(2)C.lunata CX-3基因组含有2830个保守蛋白家族,共包含有8471个蛋白,包括161个转座酶、129个g蛋白偶联受体、153个蛋白激酶、76个富含半胱氨酸小分泌蛋白(氨基酸长度小于150aa)、235个糖苷水解酶、47个abc和252个mfs转运蛋白、146个p450,36个次生代谢骨架基因;(3)鉴定出1904个病菌-寄主互作相关基因,其中包括127个蛋白激酶、70个糖苷水解酶、40个abc转运蛋白、167个mfs转运蛋白和112个p450等;(4)c.lunatacx-3编码蛋白与c.lunatam118、bipolarismaydisc5、setosphaeriaturcica、pyrenophoratritici-repentis和magnaportheoryzae氨基酸序列一致性分别为85.9%、78.6%、75.8%、70.9%和47.9%,且与b.maydis的分化时间大约是白垩纪时期(65百万年前);(5)c.lunatacx-3有较高的c→t和g→a碱基转换频率,为解释玉米弯孢叶斑病菌的致病性分化提供了遗传学证据。总之,玉米弯孢叶斑病菌基因组生物学信息的解析为全面揭示病菌致病及致病性分化的分子机制奠定了基础。2、寄主选择压力对病菌致病性的影响。首先,用c.lunata弱致病性菌株ws18分别继代接种抗性玉米种质(pob21、pob101)11代和感病玉米种质(黄早四)6代,研究寄主选择压力对病菌致病性的影响。然后,解除寄主选择压力,研究上述致病性变化的稳定性。结果显示:(1)抗性玉米种质能诱导病菌发生致病性适应性增强;(2)感病玉米种质不能明显诱导病菌发生致病性适应性增强;(3)在解除抗性寄主选择压力后,病菌致病性适应性增强明显减弱。结果表明:抗性寄主的诱导是玉米弯孢叶斑病菌发生致病性适应性变异的潜在途径;寄主的定向选择作用增加了品种抗病性丧失的风险。3、病菌致病性适应性增强相关蛋白的筛选。首先,对c.lunata的双向电泳(2de)条件进行优化。其次,提取抗性种质pob21继代诱导病菌(ws18)的第0、5、8和11代菌株的菌丝蛋白,进行2de,筛选差异表达蛋白。最后,质谱鉴定差异蛋白。结果显示:(1)等电聚焦(ief)的最佳ph范围为ph5-8;(2)在第11代诱导菌株中,获得12个上调蛋白(包含黑色素合成关键酶brn1、brn2和胁迫相关蛋白hsp70)和4个下调蛋白(包含黑色素合成关键酶scd);(3)brn1、brn2和hsp70蛋白的翻译水平与继代数和致病性呈正相关。4、通过抑制性消减杂交(ssh)文库筛选致病性适应性增强相关基因。首先,用pob21继代诱导ws18第0和11代菌株的cdna分别作对照组(driver)和实验组(tester),构建抑制性消减文库。其次,筛选文库中含单一插入序列的阳性克隆,对插入序列进行测序、处理及拼接。最后,对差异基因进行生物信息学分析,并对部分基因的表达进行rt-qpcr验证。结果显示:(1)获得188个在第11代诱导菌株中上调的基因,其中158个为已知基因,30个为新基因;(2)从158个已知基因中,筛查出14个致病(brn1、泛素基因、漆酶前体基因和锌指转录因子ace1等)和抗胁迫(超氧化物歧化酶基因sod、过氧化物氧还蛋白酶基因tsa1和热激蛋白基因hsp104等)相关基因。5、利用转录组测序(rna-seq)技术筛选致病性适应性增强相关基因。首先,对pob21继代诱导ws18第0和11代菌株分别进行转录组测序,筛选差异基因。然后,对差异基因进行生物信息学分析。结果显示:(1)在第11代诱导菌株中分别筛选出200个上调基因和164个下调基因;(2)转录上调的基因主要集中在转运、代谢、菌丝生长、胁迫反应、色素合成和蛋白水解等类群。6、致病性适应性增强相关蛋白和基因的综合分析。比较分析2de、ssh文库和rna-seq所得差异蛋白和基因,结合生物学功能筛查病菌致病性适应性增强相关蛋白和基因;绘制调控网络图。结果显示:33个蛋白和基因与病菌致病性适应性增强相关,包括4个黑色素合成蛋白和基因、14个毒素合成基因簇基因、4个抗胁迫蛋白和基因、4个多药转运蛋白基因、2个转录因子和5个其他致病相关基因。结果表明:(1)黑色素、毒素、抗氧胁迫和纤维素酶调控网络参与了病菌致病性适应性变化,且黑色素、毒素和抗氧胁迫调控网络存在交叉;(2)sod、brn1、scd、pks、ace1、tsa1、hsp70和hsp104可能与病菌致病性适应性增强关系密切,可作为病菌致病性适应性增强的候选标记基因。7、致病性适应性增强相关标记基因sod、brn1、scd、pks、tsa1和hsp70在不同致病类型菌株中的表达分析。首先,选取8个鉴别寄主分别鉴定5个c.lunata菌株的致病类型。然后,利用rt-qpcr分析致病性增强相关标记基因sod、brn1、scd、pks、tsa1和hsp70的转录水平与致病类型的对应关系。结果显示:(1)sod和tsa1在强、中等致病类型菌株中的表达相对较高,在弱、特殊致病类型菌株中的表达相对较低;(2)brn1、scd、pks和hsp70在不同致病类型菌株中的表达规律不明显。结果表明:sod和tsa1基因的转录水平与菌株的致病类型存在对应关系,可作为鉴定病菌致病性分化的标记基因。8、sod基因的功能分析。首先,构建sod基因缺失突变株Δsod和互补子;其次,比较野生型、Δsod、和互补子的生物学性状;最后,利用RT-qPCR分析sod的缺失对黑色素合成相关基因brn1、scd和毒素相关基因clt-1表达的影响。结果显示:(1)野生型、Δsod和互补子在菌落形态、细胞壁降解酶活性和毒素的致病力上没有明显差别;(2)在PD培养基中培养48 h时,Δsod的黑色素产量明显低于野生型和互补子;(3)在侵染初期,Δsod的致病性比野生型菌株和互补子弱,但到侵染后期又恢复到与野生型及互补子一致的水平;(4)sod的缺失对brn1、scd和clt-1基因的表达影响不显著。结果表明:sod有助于玉米弯孢叶斑病菌发挥其致病性,但不是致病性所必需的;sod影响黑色素形成,但影响机制尚不明确。综上所述,C.lunata CX-3全基因组信息的解析为全面揭示玉米弯孢叶斑病菌致病及致病性分化的分子机制奠定了基础。抗性寄主选择压力能诱导病菌致病性适应性增强,且黑色素、毒素、抗胁迫和纤维素酶调控网络参与了这个过程。致病性适应性增强相关标记可在翻译或转录水平上反映病菌的致病性分化。sod和tsa1可作为病菌致病性分化的标记基因,并通过调控黑色素的形成来影响病菌在侵染初期的致病性。