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岩扇贝(Crassadoma gigantea,Rock scallop)隶属于软体动物门、双壳纲(Bivalvia)、扇贝目、扇贝科,最早发现于北美太平洋沿岸地区,因具有个体大、生长速度快、抗逆性强、肉嫩味美等优点,在国际市场备受青睐。为有效缓解国内扇贝养殖品种少、病害频发、产量低、死亡率高等问题,岩扇贝作为优良品种于2012年被引进我国。目前,国内外对岩扇贝分子遗传学的研究较少。因此,本研究采用高通量转录组测序的方法和RNA-Seq技术对岩扇贝闭壳肌、鳃、外套膜及内脏团的DNA混合物进行转录组文库测序和分析。利用获得转录组数据开发岩扇贝微卫星分子标记,为其遗传多样性分析和分子遗传学研究奠定基础。 1.通过Illumina总共得到80,832,518条原始读段,去除低质量序列、rRNA和接头序列后,得到77,306,198条(95.64%)干净读段。利用这些读段进行组装,共获得到了158,855条转录本和96007条unigenes。利用生物信息学软件,从转录组数据库19182条序列中获得24795个微卫星位点,其中每条序列包含微卫星位点大于1的序列数量为4148,占比21.6%。二碱基重复5602个,三碱基重复1924个,四碱基重复186个,分别占微卫星序列总数的22.6%,7.8%和0.8%。 从中选取97对微卫星序列设计引物,42个引物扩增出目的产物,利用30个岩扇贝个体检测微卫星的多态性,其中12个证明是有多态性的位点。进一步分析结果显示等位基因数从3到9不等,平均为3.25个等位基因;观测杂合度和期望杂合度分别为0.033~0.923和0.254~0.820,其中2个微卫星位点显著偏离哈迪温伯格平衡(PHWE<0.01)。 2.本文采用PCR扩增和序列测定等技术,对岩扇贝线粒体DNA16S rRNA和COI基因片段进行了初步研究,得到16S rRNA基因片段的大小在613bp-634bp之间,A,T,G,C的平均含量分别为26.5%,29.7%,24.5%和19.3%。COI基因片段的大小为660bp,碱基A,T,G,C的平均含量分别为17%,40%,27%和15%。16S在岩扇贝中扩增偏向使用以U或G结尾的密码子,总使用度分别为12.76和8.02。其中GUU的同义密码子使用度大于2,为16S在岩扇贝中偏好行使用次数最多的。COI系统进化树表明与岩扇贝亲缘关系最近的是栉孔扇贝Azumapecten farreri,其次是Chlamys islandica。16S系统进化树亲缘关系由近到远依次是Patinopecten caurinus,Mizuhopecten yessoensis,Chlamys islandica。 转录组测序平台展示了对岩扇贝物种快速开发分子资源的能力。这些新的多态性微卫星标记对进一步的种群研究和保护遗传学提供基础资料。