人高致病性禽流感H5N1病毒(以下简称“H5N1”病毒)对人类健康的巨大威胁不仅在于造成当前严重的个体感染甚至死亡,更因为H5N1病毒有可能经过不断变异获得人际传播能力,导致新一轮人间流感大流行。因此,需要发展有效的疫苗应对H5N1病毒的潜在威胁。然而,目前H5N1病毒已通过快速变异形成多个进化分支(clade)。考虑到H5N1病毒变异及疫苗生产条件对疫苗时效性的影响,基于保守的抗原组分发展对不同进化分支H5N1病毒具有交叉免疫保护效果的通用型疫苗进行提前接种,可以在应对潜在的H5N1病毒大流行中发挥重要作用。本研究基于H5N1病毒高保守的M2e,以合成具有四分支链并联结构的M2e多抗原肽(M2e四分肽)和重组表达具有M2e与新型佐剂蛋白ASP-1串联结构的融合蛋白为策略,系统开展了H5N1病毒通用型疫苗基础研究,籍此扩展有效的H5N1病毒预防手段,加强防控H5N1病毒潜在大流行的能力。1. H5N1病毒M2e保守性和血清交叉反应性分析为了分析H5N1病毒M2e保守性,确定发展H5N1病毒通用型疫苗的靶抗原,本研究从NCBI流感资源中心调取不同时间、不同宿主来源的H5N1病毒M2蛋白全长序列进行比对,系统分析了M2e的保守性,获得了不同来源H5N1病毒株M2e的共有序列。与人流感病毒M2e共有序列比较的结果表明,两者有多个氨基酸残基存在差异;进一步的血清交叉反应实验结果表明,禽流感病人血清中可以检测到H5N1病毒M2e特异性抗体;但流感病人血清几乎不与H5N1病毒M2e抗原反应;而人流感病毒M2e特异性的小鼠免疫血清与H5N1病毒M2e抗原交叉反应的抗体滴度不足102。根据实验结果,本研究在H5N1病毒通用型疫苗设计中以M2e为靶抗原,而其序列参照H5N1病毒M2e共有序列。2.以M2e四分肽为基础的人高致病性禽流感H5N1病毒通用型疫苗研究(1)为了有效评价基于M2e发展的交叉保护性疫苗在抵御不同进化分支H5N1病毒感染时的能力,本研究以BALB/c小鼠为对象,选择clade1病毒株(A/Vietnam/1194/04)和clade2.3.4病毒株(A/Shenzhen/406H/06),建立了用于M2e疫苗攻毒保护效果评价的小鼠模型。实验结果表明,10LD50攻毒剂量下小鼠体重急剧下降,并在10天内全部死亡;肺组织病毒滴度在攻毒后第5天出现高峰,并出现了与临床上相似的肺组织病理损伤。实验最终确定以肺组织病毒滴度、肺组织病理损伤、体重变化和存活率作为最重要的评价指标来评价M2e诱导免疫保护的效果。(2)为了增强M2e的免疫原性,并在一定程度上模拟天然M2e的四聚体形式,本研究设计并合成了具有四分支链结构的M2e多抗原肽(M2e四分肽);用合成的M2e四分肽免疫小鼠,进行了免疫原性分析,并通过致死剂量(10LD50)下的攻毒试验评价了其在不同进化分支H5N1病毒攻击时的交叉免疫保护效果。实验结果表明,M2e四分肽免疫原性显著增强;M2e四分肽免疫的小鼠在clade1(A/Vietnam/1194/04)和clade2.3.4(A/Shenzhen/406H/06)H5N1病毒攻击后的肺部病毒复制显著降低、组织病理损伤明显减轻、存活率达到70%以上,表现出对不同进化分支H5N1病毒有效的交叉免疫保护效果。3.以M2e-ASP-1融合蛋白为基础的人高致病性禽流感H5N1病毒通用型疫苗研究本研究采用将M2e与新型佐剂蛋白ASP-1融合的策略进行H5N1病毒通用型疫苗研究。(1)本研究同时采用增加M2e拷贝和将M2e与佐剂活性成分相连的策略,在原核表达系统中表达单个M2e分子与ASP-1融合(M2e-ASP-1)或3个M2e分子与ASP-1融合(M2e3-ASP-1)的重组蛋白;同时表达了pET32a(+)载体无佐剂活性的伴侣分子trxA与3个M2e分子融合的重组蛋白(TrxA-M2e3)作为对照。用重组表达的融合蛋白进行了动物免疫和攻毒保护试验。实验结果表明,M2e-ASP-1和M2e3-ASP-1重组蛋白免疫时无需使用佐剂即可诱导出高滴度的M2e特异性抗体,并且可以有效诱导细胞免疫反应;而具有M2e多联体结构的M2e3-ASP-1比含有M2e单体的M2e-ASP-1免疫效果更好。使用clade1(A/Vietnam/1194/04)和clade2.3.4(A/Shenzhen/406H/06)H5N1病毒在高致死剂量病毒(10LD50)攻击后,M2e3-ASP-1重组蛋白免疫小鼠肺组织的病毒复制显著降低,病理损伤明显减轻,存活率高达70%～80%;而在3LD50致死剂量攻击下,M2e3-ASP-1重组蛋白可使免疫的小鼠全部存活,对不同进化分支H5N1病毒的攻击起到了完全的保护作用。(2)为了深入了解当H5N1病毒变异导致HA不能产生保护性免疫时M2e诱导交叉免疫保护的能力,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统重组表达了H5N1病毒A/Vietnam/1194/04株的HA抗原,并与M2e3-ASP-1重组蛋白联合免疫;参照HA抗原常规免疫程序,采用免疫两次,间隔4周的方案免疫小鼠,并使用clade1(A/Vietnam/1194/04)和clade2.3.4(A/Shenzhen/406H/06)H5N1病毒在高致死剂量病毒(10LD50)下进行攻毒保护试验。实验结果表明,HA与M2e3-ASP-1联合免疫能够同时诱导出高滴度的HA特异性抗体和M2e特异性抗体;免疫小鼠具有针对A/Vietnam/1194/04株H5N1病毒的高滴度中和抗体,并能在该株病毒攻击后全部存活;而在采用另一进化分支H5N1病毒株(A/Shenzhen/406H/06)进行的中和试验和攻毒保护试验中,该病毒株HA抗原变异导致联合免疫后的血清抗体不具中和活性;但M2e3-ASP-1的参与使联合免疫小鼠在致死剂量攻击后的存活率达到60%。相比之下,没有M2e3-ASP-1参与,HA免疫小鼠在同样剂量(10LD50)A/Shenzhen/406H/06株H5N1病毒攻击后全部死亡。本研究表明,M2e3-ASP-1重组蛋白在HA抗原因病毒变异失去免疫保护作用的情况下仍能提供有效的交叉免疫保护。4. H5N1病毒M2e四分肽对甲型H1N1流感病毒交叉免疫保护实验研究目前担心H5N1病毒变异后人间大流行的一个重要方面就是它与2009年造成全球流感大流行的甲型H1N1流感病毒重组。本研究通过分析发现,甲型H1N1流感病毒与H5N1病毒的M2e共同序列只有一个氨基酸残基不同。为了探讨H5N1病毒M2e对甲型H1N1流感病毒的交叉免疫保护作用,本研究采用H5N1病毒M2e四分肽免疫小鼠,并使用致死剂量的甲型H1N1流感病毒进行攻毒保护试验。实验结果表明,H5N1病毒M2e四分肽免疫可以诱导产生与甲型H1N1流感病毒M2e交叉反应的高滴度抗体;并在受到致死性攻击后产生完全的免疫保护,存活率达到100%。综上所述,本研究明确了H5N1病毒保守的M2e在发展H5N1病毒通用型疫苗中的重要价值;证实了本研究在发展该类疫苗时采取的设计策略对提高疫苗免疫原性和免疫保护效果的有效性;揭示了这些免疫原性增强策略对于获得和提高免疫保护效果的必要性;预示出在此基础上发展的H5N1病毒通用型疫苗对防控H5N1病毒引起的人间流感大流行具有重要意义。