随着分子生物学的发展，同源重组工程已经成为基因工程实验中常用的技术手段，广泛的应用在大肠杆菌基因组修饰，例如点突变，基因敲除等实验。相对比于传统同源的RecA重组系统，Red同源重组技术具有同源序列短(40-60 bp)、重组效率高的特点，这也是Red的到广泛应用的原因之一。　　BL21(DE3)重组体系的建立，首先对蛋白表达宿主菌BL21(DE3)中进行基因敲除的可行性进行验证即对BL21(DE3)上的recJ基因的敲除，实验证明:含50bp,500bp的重组片段均能够成功的敲入到BL21(DE3)基因组上，从而取代recJ。确定BL21(DE3)基因敲除可行后敲除BL21(DE3)基因组上的hsdR基因。核酸内切酶相关的基因hsdR-编码表达Ⅰ型限制酶EcoK(K12株)或EcoB（B株），在大肠杆菌细胞中起到一种“抗体”的作用，对外来的各种DNA有严格的限制。hsdR基因的变异或者缺失会导致菌株细胞内的Ⅰ型限制酶EcoK或EcoB活性缺失，这对于外来基因的导入及质粒转化是有利的。本实验通过同源重组的方法将BL21(DE3)中的hsdR基因敲除掉，通过验证得到正确的菌株BL21(DE3)ΔhsdR，再对其的效率进行验证。实验结果表明，在将hsdR基因敲除后，电转化效率提高了3-5倍。　　TEV Protease(TEV蛋白酶)是来源于烟草蚀纹病毒(TEV)的Nla(Nuclearinclusion a protein)蛋白酶，它常被用来切除融合蛋白的亲和标签。在融合标签和目的蛋白之间加入酶切位点，TE V蛋白酶酶切后，便可将目的蛋白和融合标签分开，有利于目的蛋白的纯化。以往，本实验室目的蛋白的纯化，首先是要对融合蛋白进行表达继而根据纯化标签选择纯化方法，得到纯化的融合蛋白后，需要对其进行蛋白酶切，再次对酶切液进行纯化，最终获得所需要的目的蛋白，经过两次纯化需要的目的蛋白有严重的损失。本实验室纯化出的TEV蛋白酶无论从纯度和量以及活性上都能够达到酶切条件的要求，所以我们就想利用同源重组和TEV蛋白酶的优点构建一种体系:TEV蛋白酶在细胞内剪切融合蛋白，将表达TEV蛋白酶的基因整合到蛋白表达菌株BL21(DE3)的基因组上，通过诱导表达出TEV蛋白酶，直接实现融合蛋白酶切。　　利用Red重组方法构建了融合有表达TEV蛋白酶基因的菌株-LS1911((BL21(DE3)ΔaraBAD::pBAD-bla-mTEV)，在实验过程中，我们发现只有含有500bp的重组片段能够成功的敲入到基因组上，可能的原因是敲入和敲除的片段相对较长。但蛋白表达的实验中并没有获得我们预期的结果，TEV蛋白酶并没有发生表达。由此实验对表达蛋白酶的启动子进行了改进，将cat-tetR-ptetA基因盒整合至菌株LS1911(BL21(DE3)ΔaraBAD::pBAD-mTEV-bla，pLS1668)基因组的mTEV上游，使mTEV置于ptetA启动子之下，受热失活氯四环素诱导表达。出现的结果均为异常重组，条件优化的后续实验正在进行之中。