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本文首先建立了适应于筛选降尿酸多肽类物质的体外测定方法,在此基础上,通过制备磁性壳聚糖微球,构建“磁性微球固定化黄嘌呤氧化酶”分离工具,以亲和吸附的原理从蛋白酶解液中特异性吸附分离降尿酸肽,为从蛋白酶解液中富集降尿酸关键肽提供了理论指导和技术支撑。采用双酶偶联法联合高效液相色谱法(HPLC法)测定多肽类物质的体外黄嘌呤氧化酶(XO)抑制活性。以双酶偶联法优化样品测定的反应体系,得到最适反应条件为:黄嘌呤浓度0.22 mM,酶浓度0.52 u/mL,缓冲液pH 8.0,反应温度30℃,反应时间20min;优化了尿酸分离的液相条件,确定最适检测条件为:95%15 mM NH4H2PO4+5%甲醇,pH 6.5,流速1 mL/min,柱温25℃,检测波长290 nm。双酶偶联法联合HPLC法结果表明还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)具有黄嘌呤氧化酶抑制活性,可作为降尿酸肽。采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性颗粒,并以此为磁核通过乳液聚合法制备磁性壳聚糖微球,以环氧氯丙烷对微球表面进行活化,用于黄嘌呤氧化酶的固定化研究。以微球表面的环氧基密度为活化指标,确定了活化过程的最适工艺条件:环氧氯丙烷体积分数为40%,NaBH4浓度为0.60 g/L,NaOH浓度为1.20 mol/L。对微球进行结构表征,结果表明:壳聚糖成功包裹了Fe3O4磁性粒子,且已活化微球表面具有环氧基活性基团;Fe3O4磁性粒子、未活化和已活化磁性壳聚糖微球的中径分别为2.16、20.30、24.69μm。活化结束后,将黄嘌呤氧化酶固定在磁性微球上,构建磁性微球固定化黄嘌呤氧化酶,以酶活为指标,确定最适固定化工艺为:时间1 h,温度30℃,pH 8.0。对磁性微球固定化黄嘌呤氧化酶的酶学性质研究,结果表明:酶的最适作用温度为48℃,最适作用pH为8.5,酶具有一定的重复使用性,良好的热稳定性、pH稳定性和储存稳定性。采用磁性微球固定化黄嘌呤氧化酶亲和吸附降尿酸物质(别嘌呤醇和GSH),别嘌呤醇初始浓度为3 mM,吸附时间为2 h,吸附温度为40℃,缓冲液pH为7.5时,对别嘌呤醇的最大吸附量为67.19±1.89μM/g;GSH初始浓度为50 mg/mL,吸附时间为2 h,吸附温度为40℃,缓冲液pH为7.5时,对GSH的最大吸附量为1572±49.36 mg/g。采用高效液相色谱研究了不同的洗脱剂对GSH的洗脱效果,选择以NaCl+HCl作为GSH的洗脱剂。采用高效液相色谱研究了磁性微球固定化黄嘌呤氧化酶与磁性微球对GSH的吸附洗脱效果,实验结果表明磁性微球固定化黄嘌呤氧化酶对GSH的吸附属于特异性吸附。