研究目的：通过检测乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中全长型神经激肽受体-1(Neurokinin-1receptor Fulllength, NK1R-FL)和截短型神经激肽受体-1(Neurokinin-1receptor Truncated, NK1R-Tr)的表达,并研究二者对乳腺癌细胞生物学行为的影响,探讨NK1R-FL和NK1R-Tr与乳腺癌侵袭转移的相关性,判断NKIR-Tr是否具备癌基因的特性；利用乳腺癌细胞和人骨髓间充质干细胞的体外共培养系统,分析NK1R表达的变化对促进乳腺癌细胞在骨髓中长入的作用；判定TGF-β、SDF-1α是否通过调节NKIR-Tr表达,维持乳腺癌细胞在进入骨髓基质早期的静息状态,为乳腺癌骨转移的靶向和预防性治疗提供参考。研究方法：本课题分四部分进行研究：第一部分：用免疫组织化学法检测41例乳腺癌组织、30乳腺良性病变和20例正常乳腺组织的NK1R和NK1R-FL的表达,并对不同分型、分期和有无淋巴结转移的乳腺癌组织NK1R和NK1R-FL的表达进行分析比较；用Real-time PCR和Western Blot法对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、T-47D、MCF-7、SK-Br-3、非肿瘤源性的人乳腺上皮细胞HBL-100和人骨髓间充质干细HMSC-bm的NK1R-FL、 NK1R-Tr基因和蛋白表达水平进行检测分析,同时应用Real-time PCR和Western Blot/ELISA法检测上述细胞系的NK2R和SP表达。第二部分：建立NKIR-Tr稳定过表达的HBL-100-NK1R-Tr细胞和NK1R-FL稳定过表达的MDA-MB-231-NK1R-FL细胞,用Real-time PCR和Western Blot法对两个细胞株NK1R-FL和NKIR-Tr的基因和蛋白表达进行鉴定；以未转染和pEGFP-C2空载体转染的MDA-MB-231细胞和HBL-100细胞为对照,NK1R-Tr和NK1R-FL的稳定过表达细胞株进行细胞生长曲线分析、细胞周期测定、用体外细胞粘附试验和Transwell小室体外侵袭与迁移试验；用Real-time PCR和Western Blot法测定NK1R-Tr和NK1R-FL的稳定过表达细胞株NK2R基因和蛋白的表达水平,用MTS/PMS法和软琼脂集落形成试验检测在NK1R和NK2R受体拮抗剂存在下其增殖和锚定非依赖性生长情况；荧光标记NKIR-Tr细胞和NK1R-FL过表达细胞,注射裸鼠的尾静脉,用小动物活体成像系统对裸鼠进行肺、肝和骨转移活体检测,切除裸鼠的肺和肝组织,石蜡切片进行HE染色,分析肺和肝转移情况。第三部分：建立高转移性的乳腺癌细胞MDA-MB-231和人骨髓间充质干细胞HMSC-bm的共培养体系,在共培养的不同汇合状态,分离乳腺癌细胞,用Real-time PCR、Western Blot和流式细胞术的间接免疫荧光法检测NK1R-FL、 NK1R-Tr的基因和蛋白表达水平,并进行分析。第四部分：应用RNA干扰技术,构建MDA-MB-231-SDF-1αⅠ和MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ稳定表达抑制细胞株,用Real-time PCR法和ELISA法分别对稳定株的SDF-1α和TGF-β1的基因和蛋白蛋白表达抑制情况进行鉴定;用Real-timePCR法和ELISA法分别测定的MDA-MB-231细胞、HBL-100细胞、HBL-100-NKlR-Tr和HMSC-bm细胞SDF-1α的分泌表达；建立MDA-MB-231-SDF-1αⅠ和HMSC-bm的共培养体系,荧光显微镜下观察细胞生长情况,在培养汇合早期分离MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞,用Real-time PCR法和Western Blot法检测分离前后NK1R-FL和NK1R-Tr的表达情况；在共培养体系中分别加入人重组的SDF-1α因子或SDF-1α中和抗体,分离MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞,检测NK1R-FL和NK1R-Tr的表达情况；用Real-time PCR法和ELISA法分别测定的MDA-MB-231细胞、HBL-100细胞、HBL-100-NK1R-Tr和HMSC-bm细胞TGF-β1的分泌表达,荧光显微镜下观察细胞生长情况,并在培养汇合早期分离MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞,用Real-time PCR法和Western Blot法检测分离前后NK1R-FL和NK1R-Tr的表达情况；在共培养体系中分别加入人重组的TGF-β1因子或TGF-β1中和抗体,分离MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞,检测NK1R-FL和NK1R-Tr的表达情况。研究结果：第一部分：(1)乳腺癌临床组织标本研究结果显示：乳腺癌组织NK1R的表达与乳腺良性病变和正常乳腺组织相比差别无统计学意义,且不同乳腺癌分型、分期和有无淋巴结转移的乳腺癌组织NK1R的表达差别均无统计学意义(P>0.05)；乳腺癌组织NK1R-FL表达与正常乳腺癌组织相比显著降低,且在浸润性导管癌和导管内癌组织中均降低,在浸润性导管癌中下降更为显著(P<0.05)；不同分期乳腺癌组织NK1R-FL表达与正常乳腺癌组织相比均显著降低,且随组织分期的升高而逐渐降低(P<0.05)；有、无淋巴结转移的乳腺癌组织NK1R-FL表达均显著低于正常乳腺组织(P<0.05),且有淋巴结转移的乳腺癌组织NK1R-FL表达降低更为显著。(2)对不同的乳腺癌细胞系、非肿瘤源性的乳腺上皮细胞系和人骨髓间充质干细胞的研究结果显示：所有细胞均表达NK1R-Tr基因和蛋白,但MDA-MB-231细胞、T-47D和MCF-7细胞只表达NKIR-Tr基因和蛋白,且其表达水平显著高于SK-Br-3细胞、HBL-100细胞和HMSC-bm细胞(P<0.05);SK-Br-3细胞低表达NK1R-FL基因和NK1R-Tr基因；HBL-100细胞和HMSC-bm细胞均高表达NK1R-FL基因和蛋白,其表达水平显著高于SK-Br-3细胞(P<0.05);SK-Br-3细胞NK1R-Tr基因和蛋白表达与HBL-100细胞和HMSC-bm细胞无显著性差别。HBL-100细胞的PPT基因和SP的分泌表达均显著高于其它各组细胞(P<0.05),其它各组细胞间无显著性差别(P>0.05)。相较于NK1R-FL和NKIR-Tr基因和蛋白,各组细胞均低表达NK2R基因和蛋白,HBL-100细胞和HMSC-bm细胞的NK2R表达高于MDA-MB-231细胞、T-47D、MCF-7和SK-Br-3,但无显著性差别(P>0.05)。第二部分：(1)构建了能稳定过表达NK1R-FL和NK1R-Tr基因的MDA-MB-231和HBL-100细胞株,用Real-time PCR和Western Blot法对两个细胞株NK1R-FL和NK1R-Tr的进行鉴定：MDA-MB-231-NK1R-FL细胞与MDA-MB-231细胞相比,NK1R-FL明显表达；HBL-100-NKlR-Tr比HBL-100细胞NK1R-Tr表达上升1.9倍。(2)细胞生长曲线分析表明：与未转染和pEGFP-C2空载体转染的MDA-MB-231细胞相比,MDA-MB-231-NK1R-FL细胞的生长速度明显降低(P<0.05);与未转染和pEGFP-C2空载体转染的HBL-100细胞相比,HBL-100-NK1R-Tr细胞生长速度加快,但差别无显著性(P>0.05)。细胞周期测定结果表明：与未转染和空载体转染的细胞相比,MDA-MB-231-NK1R-FL细胞的G1期百分比显著升高、G2和S期细胞百分比显著下降,HBL-100-NKlR-Tr细胞的G1期百分比下降,G2和S期细胞百分比升高但变化不显著。Matrigel胶的体外细胞粘附试验显示：与未转染和空载体转染的细胞相比,MDA-MB-231-NK1R-FL细胞的粘附率显著下降(P<0.05),HBL-100-NK1R-Tr细胞粘附率显著升高(P<0.05)。Transwell小室体外侵袭与迁移实验结果均显示：与未转染和空载体转染的细胞相比,MDA-MB-231-NK1R-FL细胞的侵袭和迁移能力均下降(P<0.05),HBL-100-NK1R-Tr细胞的侵袭和迁移能力的均升高(P<0.05)。(3) NK1R-Tr与NK1R-FL和NK2R的反馈调节研究结果显示：与未转染和pEGFP-C2空载体转染的细胞相比,MDA-MB-231-NK1R-FL的NK2R表达升高,HBL-100-NKlR-Tr的NK2R表达下降(P<0.05); NK1R受体拮抗剂可以抑制MDA-MB-231-NK1R-FL细胞在体外的增殖,不同浓度下的抑制率与MDA-MB-231和MDA-MB-231-C2对照组比较均有显著性差异(P<O.05),并且随药物浓度的升高及作用时间的延长,抑制率逐渐增加,最高抑制率为56.8%；HBL-100-NK1R-Tr细胞在NK1R受体拮抗剂浓度为2μmol/L开始增殖受抑制,随浓度升高抑制率升高,但不同浓度下的抑制率均显著低于HBL-100和HBL-100-C2细胞,最高抑制率为31.6;NK2R受体拮抗剂可以随浓度升高抑制MDA-MB-231-NK1R-FL细胞在体外的增殖,不同浓度下的抑制率与MDA-MB-231和MDA-MB-231-C2对照组比较均升高,但在低浓度下差异尤其显著(P<O.05),最高抑制率为66.3%；同样条件下,HBL-100-NKlR-Tr细胞在NK1R受体拮抗剂浓度为2μmo1/L开始增殖受抑制,而HBL-100和HBL-100-C2细胞在1μmol/L开始增殖受抑制,各组细胞均随浓度升高抑制率升高,但HBL-100-NKlR-Tr细胞在不同浓度下的抑制率均低于HBL-100和HBL-100-C2细胞,在低浓度下,抑制率降低更显著,最高抑制率为58.6；在无拮抗剂、NK1R和NK2R受体拮抗剂存在条件下,MDA-MB-231-NK1R-FL细胞软琼脂集落形成能力均显著低于MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231-C2细胞(P<0.05)；在无拮抗剂存在下,HBL-100-NK1R-Tr细胞软琼脂集落形成能力高于HBL-100和HBL-100-C2细胞,但无显著性差别(P>0.05),在NK1R和NK2R受体拮抗剂存在条件下集落形成能力则均显著高于HBL-100和HBL-100-C2细胞(P<0.05)(4)裸鼠的体内研究表明：裸鼠尾静脉MDA-MB-231-NK1R-FL细胞相较于MDA-MB-231细胞,小动物活体成像系统显示肺、和骨转移显著降低,肺组织的大体标本和HE染色的转移灶计数均显著降低；裸鼠尾静脉注射HBL-100细胞未见肺、肝、骨的转移灶,HBL-100-NKlR-Tr细胞裸鼠尾静脉5周后肺组织HE染色即发现肺微小转移灶,8周后X-Ray可检测到骨转移灶。第三部分：(1)相较于单独培养的两种细胞,MDA-MB-231细胞和HMSC-bm细胞的共培养显示：MDA-MB-231细胞和HMSC-bm细胞的1：100共培养体系中,MDA-MB-231细胞不生存；1：10共培养体系中,MDA-MB-231细胞生存但不增殖,HMSC-bm生长速度不改变；1：1共培养体系中,直到细胞生长汇合达到40%,乳腺癌细胞生长缓慢,HMSC-bm细胞包绕MDA-MB-231细胞生长,且生长速度较单独培养快,当细胞汇合达到超过60%后,两种细胞生长速度均加快并相互融合,HMSC-bm细胞失去正常形态且与MDA-MB-231细胞无法区分。HBL-100细胞在与HMSC-bm细胞的共培养体系中不生存。(2)在MDA-MB-231细胞和HMSC-bm细胞的1：1共培养体系中,分别待其细胞汇合达到20%、40%和60%分离MDA-MB-231细胞,测定NK1R-FL和NK1R-Tr基因和蛋白表达：在各汇合点,NK1R-FL均不表达；在20%、40%汇合点,NK1R-Tr低表达；在60%汇合点,NK1R-Tr表达开始升高。在各汇合点PPT基因和SP的分泌表达、NK2R基因和蛋白表达变化均不显著。第四部分：(1)应用RNA干扰技术和脂质体转染技术并经G418筛选构建了SDF-1α和TGF-β1基因稳定抑制的MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞株和MDA-MB-231-TGF-βⅡ细胞株,用Real-time PCR法和ELISA法鉴定表明对SDF-1α和TGF-β1的表达抑制率分别达到99%和81%。(2) Real-time PCR法和ELISA法检测结果显示：SDF-1α基因和蛋白在HMSC-bm细胞显著高表达,HBL-100-NK1R-Tr细胞SDF-1α的表达显著低于HBL-100细胞(P<0.05)；将MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞与HMSC-bm细胞等量共培养,以空载体转染的MDA-MB-231-KB和未转染的细胞为对照,MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞在共培养的早期(24h,48h)生长速度加快。在MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞与HMSC-bm细胞的共培养体系中加入人重组的SDF-1α因子后,明显促进了共培养体系中HMSC-bm细胞的生长,抑制了MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞的生长。在MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞与HMSC-bm细胞的共培养体系中加入SDF-1α的中和抗体后,MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞的生长进一步加快。相较于未转染和空载体转染的MDA-MB-231细胞,MDA-MB-231-SDF-1αⅠ细胞的NKIR-Tr表达升高；MDA-MB-231-SDF-1αⅠ与HMSC-bm共培养24小时分离后,NKIR-Tr表达降低；在MDA-MB-231-SDF-1αⅠ与HMSC-bm共培养24小时后的体系中加入人重组SDF-1α因子作用24小时再分离后,NKIR-Tr表达进一步降低；在MDA-MB-231-SDF-1αⅠ与HMSC-bm共培养24小时后的体系中加入SDF-1α中和抗体作用8小时并分离后,NK1R-Tr表达升高;各处理因素下NK1R-FL均未见表达。(3) Real-time PCR法和ELISA法检测结果显示：MDA-MB-231、HMSC-bm、 HBL-100-NK1R-Tr和HBL-100各组细胞的TGF-β1表达水平均较高,HBL-100-NK1R-Tr细胞的TGF-β1表达水平较HBL-100细胞显著升高(P<0.05)。将MDA-MB-231-TGF-β1细胞与HMSC-bm细胞等量共培养,以空载体转染的MDA-MB-231-KB和未转染的细胞为对照,MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞在共培养的早期(24h,48h)生长速度明显加快,HMSC-bm细胞的生长速度减慢;在MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞与HMSC-bm细胞的共培养体系中加入人重组的TGF-β1因子后,共培养体系中HMSC-bm细胞和MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞的生长均受到了抑制;在MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞与HMSC-bm细胞的共培养体系中加入TGF-β1的中和抗体后,MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞的生长进一步加快。应用Real-time PCR的mRNA表达结果和Western blots的蛋白表达结果均显示：相较于未转染和空载体转染的MDA-MB-231细胞,MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ细胞的NKIR-Tr表达降低；MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ与HMSC-bm共培养24小时分离后,NK1R-Tr表达进一步降低；在MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ与HMSC-bm共培养24小时后的体系中加入人TGF-β1重组因子,继续培养24小时分离后,NK1R-Tr表达升高；在MDA-MB-231-TGF-β1Ⅰ与HMSC-bm共培养24小时后的体系中加入TGF-β1中和抗体继续培养8小时分离后,NK1R-Tr表达降低;各处理因素下NK1R-FL均未见表达。结论：(1)乳腺癌组织与细胞系研究结果均表明：随着乳腺癌的发生、发展和浸润转移,NK1R-FL的表达逐渐降低,而NK1R-Tr的表达则逐渐升高,NK1R-FL的表达下调及NK1R-Tr表达的上调可能成为预示乳腺癌浸润转移的一个重要指标。(2)体外和裸鼠体内研究结果均表明：NK1R-FL乳腺癌细胞的生长、增殖、粘附、侵袭和迁移起抑制作用,而NK1R-Tr对乳腺癌细胞的生物学作用则与之相反,提示NK1R-Tr可能具备膜受体型的癌基因性质；乳腺癌细胞NK1R-Tr表达的增加,使其对NK1R和NK2R的受体拮抗剂的敏感度降低,NK1R-FL的表达则增加了对NKlR和NK2R的受体拮抗剂的敏感度,结果提示NK1R-Tr受体的细胞内缺失段是NK1R信号传导和脱敏的关键区域,并因此影响了NK1R受体的自分泌调节及与NK2R受体的反馈调节。(3) MDA-MB-231细胞和HMSC-bm的共培养结果表明,以HMSC-bm细胞为代表的骨髓基质微环境抑制了进入骨髓的乳腺癌细胞的生长,乳腺癌细胞NKIR-Tr表达的下调可能是维持乳腺癌细胞在骨髓基质微环境中呈静息状态的一个重要因素。(4)乳腺癌细胞SDF-1α因子表达的上调与NKIR-Tr的高表达呈负相关,HMSC-bm细胞SDF-1α分泌表达可能是乳腺癌细胞在骨髓基质微环境中维持静息状态和NKIR-Tr低表达的原因之一；乳腺癌细胞TGF-β1的表达与NK1R-Tr的表达呈正相关,乳腺癌细胞TGF-β1基因被抑制后,NKIR-Tr表达虽然降低,但乳腺癌细胞迅速长入骨髓基质,这预示着骨髓基质微环境中的TGF-β1也是乳腺癌细胞在骨髓基质微环境中维持静息状态的重要因素,但其作用机制可能是通过NKIR-Tr之外的其它因素。