目的:亚急性甲状腺炎(Subacute thyroiditis,SAT)是常见的甲状腺炎症性疾病,按照疾病表现可分为急性期,缓解期和恢复期。目前已证实SAT急性期治疗是本病的关键,也是中医治疗的优势期。本文首先通过文献学研究,对“火郁发之”理论进行系统溯源,再论述导师基于“火郁发之”理论采用“升阳清热”法治疗本病的理论依据和组方思想;其次通过临床观察,客观评价“升阳清热”法治疗热毒炽盛型急性期SAT的疗效及安全性;再次,应用Meta分析,验证高师提出的“升阳清热”法治疗SAT的疗效和安全性;最后,体外实验研究观察“升阳清热”法干预腺病毒致甲状腺滤泡上皮Nthy-roi3-1细胞感染的焦亡过程,阐释其治疗急性期SAT的作用机制。材料与方法:1.“火郁发之”理论用于热毒炽盛型急性期SAT治疗的理论研究1.1“火郁发之”理论溯源:将“火郁发之”文献进行深度挖掘,采用文献学、逻辑学的方法,对“火郁发之”的理论内涵进行梳理,其内容包括“火”、“郁”、“发”各自的内涵,历代医家对“火郁发之”的认知以及“火郁发之”代表方剂分别进行阐述。1.2吾师高天舒教授运用“火郁发之”理论论治SAT思想传承:从定义、病因病机、理法方药等方面,阐释吾师高天舒教授对于SAT论治理念。论述基于“火郁发之”理论的中药复方瘿痛饮治疗热毒炽盛型急性期SAT的理论基础和组方思想。2.“升阳清热”法治疗热毒炽盛型急性期SAT的临床疗效观察本课题采取随机、对照的临床试验方法,观察病例均为在2017年01月至2019年12月期间于辽宁中医药大学附属医院内分泌科就诊的初诊未经治疗的急性期SAT(热毒炽盛证)患者,本研究共纳入合格病例共计60人。结合诊断标准纳入患者,并符合参考2002年《中药新药临床研究指导原则》,符合热毒炽盛证候。采用随机对照方法分为强的松组和中药组。中药组采用具有“升阳清热”中药复方瘿痛饮,由导师高天舒教授自拟,具体组成如下:升麻、柴胡、僵蚕、薄荷、黄连、黄芩、牛蒡子、生甘草、桔梗、板蓝根、连翘、玄参、蝉蜕、姜黄,实验观察期为疗程均为4周,随访时间为12周。观察指标包括疼痛改善程度、疼痛缓解时间,退热时间,甲状腺肿大消退程度及时间、中医症状积分改善率、中医证候改善率、甲状腺功能、血沉、SAT复发率、甲减发生率以及安全性指标、依从性指标和不良事件等。3.“升阳清热”法治疗SAT有效性及安全性的Meta分析基于中国生物医学文献数据库(CBM)、CNKI中国期刊全文数据库、万方数据知识服务平台、维普中文科技期刊数据库、pubmed数据库、Embase数据库、Cochrane对照试验中心数据库等七个数据库进行系统文献搜索,共得到243篇SAT文献,经剔除重复,综述、系统评价等文章以及筛除研究内容不符、设计不严谨等文献后,应用Meta分析对“升阳清热”法治疗SAT的有效性和安全性进行验证,指标包括总体有效率、中医症状积分改善率、中医证候改善率、疼痛缓解程度及止痛时间、退热时间、甲状腺肿大消退程度及时间、心悸、烦躁易怒症状、甲状腺功能、血沉、不良反应、SAT复发率、甲减发生率及等指标。4.“升阳清热”法干预腺病毒致甲状腺滤泡上皮Nthy-roi3-1细胞感染的焦亡过程的体外研究4.1制备含药血清:50只健康、雄性、清洁级、200±20g体重的Wistar大鼠(购于辽宁长生生物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(辽)2010-0001)采用随机数字表法随机分成5组(空白组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、强的松组),每组10只。受试方剂瘿痛饮,其中中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组分别按照正常成人的0.5、1.0、2.0倍剂量。经过换算,低剂量组药物浓度=0.33g/ml,中剂量组药物浓度=0.67g/ml,高剂量组药物浓度=1.32g/ml,每次灌胃剂量为1ml/100g,每日3次,连续灌胃7d。强的松组大鼠,按照成人10mg日三次正常剂量计算,将醋酸波尼松龙用0.9%Nacl溶解为0.156mg/ml浓度,每次灌胃剂量为1ml/100g,每日3次,连续灌胃7d。大鼠空白组大鼠则予生理盐水1ml/100g,每日3次,连续灌胃7d。7d后处死大鼠,经腹主动脉采血,离心、灭活补体、过滤细菌后置于EP管中,密封保存于-80℃冰箱中。4.2培养细胞:正常人甲状腺滤泡上皮Nthy-roi3-1细胞购自上海衡生物科技有限公司,在进行含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基,细胞培养箱(环境温度37℃、5%CO2、相对饱和湿度)下细胞培养,1:2传代。4.3腺病毒感染:随机将Nthy-roi3-1细胞分为2组,即空白组和模型组。将模型组腺病毒感染成功后,将其随机分为5组,分别为模型组、强的松组、中药低剂量组、中药中剂量组和中药高剂量组。按照分组组别将模型组、强的松组、中药低剂量组、中药高剂量组进行腺病毒感染。将各组Nthy-roi3-1细胞对应加用含药血清,其中空白组为正常大鼠血清+正常非腺病毒感染细胞;模型组为正常大鼠血清+腺病毒感染细胞;强的松组为强的松含药血清+腺病毒感染细胞;中药低剂量组为低剂量中药含药血清+腺病毒感染细胞;中药中剂量组为中剂量中药含药血清+腺病毒感染细胞;中药高剂量组为高剂量中药含药血清+腺病毒感染细胞。分别应用免疫荧光法观察细胞中的Caspase-1蛋白含量,免疫化学发光法测定的细胞上清液T3、T4水平,比色法测定细胞上清液LDH,ELISA检测各组细胞上清液IL-1β、IL-18水平,Western-blot测定细胞GSDMD-N、Caspase-1、NLRP-3、ELAVL-1蛋白表达,Real-time PCR测定细胞Tg、TPO、Caspase-1、NLRP-3、ELAVL-1 m RNA表达,Annexin V-FITC/PI染色检测细胞焦亡水平。结果:1.“火郁发之”理论用于热毒炽盛型急性期SAT治疗的理论研究分别阐述了“火”、“郁”、“发”各自的概念涵义,并解释了“火郁”的成因和种类、“发之”的适用范围和具体方法。分别比较各朝代对于“火郁发之”的理论认知,总结出“火郁发之”理论涵义由《内经》中五运六气“郁”、“发”到金元时期的发表出汗,到最终采用“因势利导”治疗火热性疾病的转变过程。从经方、验方的角度系统阐述“火郁发之”代表方剂和组方思想。最后以“火郁发之”理论为基础,深入传承吾师高天舒教授对热毒炽盛型急性期SAT的论治理论,并对自创中药复方瘿痛饮治疗本病的组方理论依据进行阐释。2.“升阳清热”法治疗热毒炽盛型急性期SAT的临床疗效观察2.1 VAS疼痛评分:治疗2周时,中药组改善VAS疼痛评分疗效优于强的松组(P=0.020<0.05);治疗4周时,中药组与强的松组两组疗效相当,无统计学差异。(P=0.307>0.05)。2.2甲状腺肿大程度测定:分别于治疗前、2周、4周和16周对各组患者甲状腺肿大程度进行触诊,两组患者甲状腺肿大程度均随时间推移而逐步减小,且2周、4周时中药组与强的松组相比差异无统计学意义(2周:P=0.281>0.05,4周:P=0.875>0.05);随诊观察第16周时,中药组甲状腺肿大程度明显小于强的松组且差异有统计学意义(P=0.039<0.05)。2.3退热时间、疼痛消失时间:中药组退热时间(5.90±2.81天)与强的松组(6.60±4.06天)相比无显著差异(P=0.375>0.05),中药组疼痛消失时间(6.87±2.35天)与强的松组(10.00±5.78天)相比明显缩短,且差异有统计学意义(P=0.025<0.05)。2.4中医症状量化评分及中医证候疗效:治疗4周后与治疗前相比,中药组(3.57±4.20)与强的松组(7.37±6.75)中医症状量化评分均有显著降低(P=0.000<0.01,P=0.000<0.01),且中药组中医症状评分明显低于强的松组(P=0.009<0.01),中医证候疗效明显优于强的松组(P=0.026<0.05)。2.5甲状腺功能:治疗4周后与治疗前相比,中药组与强的松组血清FT3、FT4均有明显下降,TSH明显升高,但两组之间差异无统计学意义(FT3:P=0.774>0.05,FT4:P=0.264>0.05,TSH:P=0.186>0.05)。2.6血沉:治疗2周、4周时,中药组和强的松组ESR水平均成下降趋势,但两组之间差异均无统计学意义(2周:P=0.744>0.05,4周:P=0.526>0.05)。2.7复发率、甲减发生率:在第16周时,中药组治疗后无病例复发,强的松组有1例复发;中药组甲减发生2例(甲减发生率6.7%),强的松组发生3例(甲减发生率10%),就复发率和甲减发生率而言,两者差异无统计学意义(P=0.313>0.05,P=064>0.05)。2.8安全性指标:对治疗前后血、尿常规、肝肾功能、心电图进行检测,结果除强的松组治疗后白细胞总数(8.03±1.47^109/L)出现显著上升(正常范围内)外,两组其他指标均无异常。2.9不良事件及依从性指标:不良事件强的松组1例,中药组0例,两组比较无统计学意义(P=0.313>0.05)。依从性方面,中药组95.87±5.70(%),强的松组94.10±6.17(%),均>80%,经秩和检验分析后表明差异无统计学意义(P=0.227>0.05)3.“升阳清热”法治疗SAT有效性及安全性Meta分析经严格筛查文献,排除不合格文献223篇,本研究共纳入20篇文献,累计1445例病例数。3.1“升阳清热”法可以提高SAT治疗总体有效率,显著提高证候有效率。在改善SAT症状方面,“升阳清热”法在改善颈前疼痛、缩短疼痛时间,缩小颈前肿大、减轻心悸、烦躁易怒等方面优于西药常规治疗;在退热时间,缩小甲状腺肿时间上与西药常规治疗相当。3.2检验指标方面,“升阳清热”法改善能够下调FT3,FT4指标,但目前仍需更多的临床临床观察佐证。“升阳清热”法在上调TSH、及下降ESR方面与西医常规治疗相当,但联合西药常规治疗后明显优于单纯西医常规治疗。3.3在不良反应、SAT复发率、甲减发生率等方面,“升阳清热”法均优于西医常规治疗。4.“升阳清热”法干预腺病毒致Nthy-roi3-1细胞感染的焦亡过程的体外研究4.1免疫荧光检测Caspase-1:模型组荧光强度明显增强,而各中药组和强的松组荧光均有不同程度减弱。免疫荧光观察,造模后Caspase-1大量表达于细胞质中,各组实验药物能够不同程度下调Caspase-1表达水平。4.2免疫化学发光法检测细胞上清液T3、T4:模型组T3、T4与空白组比较均明显升高,提示造模后存在甲状腺滤泡上皮细胞破坏,甲状腺激素释放。各用药组与模型组相比T3、T4水平均有不同水平的下调,其中中药中剂量、高剂量组、强的松组T3水平与模型组相比均有显著下调,但三者相比差异无统计学意义;观察T4水平变化,中药中剂量组(9.483±0.194ng/ml)、高剂量组(10.267±0.121ng/ml)、强的松组(10.233±0.258ng/ml)与模型组(26.033±0.258ng/ml)相比均有显著下调,且中药中剂量组T4水平与强的松组相比显著降低,差异有统计学意义(P=0.000<0.01)。4.3比色法测定细胞上清液LDH含量:与空白组相比模型组细胞死亡率显著增高,其他用药组与模型组相比细胞死亡率均有不同程度下调,其中中药中剂量组(14.267±0.476%,P=0.000<0.01)和中药高剂量组细胞(14.700±0.623%,P=0.000<0.01))死亡率显著低于强的松组(18.983±0.691%),且差异有统计学意义4.4 ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-18水平:与空白组相比模型组细胞上清液中的IL-1β、IL-18水平显著升高。各实验药物组与模型组相比,IL-1β、IL-18水平均显著下调。其中中药中剂量组、高剂量组与强的松组相比IL-1β(P=0.216>0.05)、IL-18水平(P=0.530>0.05),无统计学差异。4.5 Western blot检测细胞Caspase-1、ELAVL-1、GSDMD-N、NLRP-3蛋白表达水平:与空白组相比,模型组Caspase-1、ELAVL-1、GSDMD-N、NLRP-3蛋白表达水平显著增高,各实验药物组与模型组相比各指标蛋白表达水平均有不同程度降低。其中中药中剂量组在下调Caspase-1(P=0.019<0.05)、ELAVL-1(P=0.016<0.05)、GSDMD-N(P=0.011<0.05)、NLRP-3(P=0.006<0.01)蛋白表达水平方面明显优于强的松组,差异均有统计学意义。4.6 Real-time PCR检测细胞中Tg、TPO、Caspase-1、NLRP-3、ELAVL-1 m RNA:与空白组相比,模型组Tg、TPO、Caspase-1、NLRP-3、ELAVL-1 m RNA水平均显著增高,各实验药物组与模型组相比各指标m RNA水平均有不同程度降低。中药中剂量组在下调Tg(P=0.000<0.01)、TPO(P=0.000<0.01)、Caspase-1(P=0.000<0.01)、ELAVL-1m RNA(P=0.000<0.01)、NLRP-3(P=0.000<0.01)转录水平方面明显优于强的松组。4.7细胞Annexin V-FITC PI染色:与空白组相比,模型组Annexin V(+)/PI(+)和Annexin V(+)/PI(-)细胞比例显著升高。各实验药物组Annexin V(+)/PI(+)和Annexin V(+)/PI(-)细胞比例与模型组均有不同程度降低。其中中药中剂量组、高剂量组Annexin V(+)/PI(+)细胞比例均显著低于强的松组,但Annexin V(+)/PI(-)细胞比例与强的松组相比无显著差异。结论:1吾师高天舒教授基于“火郁法之”理论提出的“升阳清热”法是治疗热毒炽盛型急性期SAT行之有效且安全的治法。2“升阳清热”法能够改善热毒炽盛型急性期SAT患者缓解疼痛、缩短发热时间、减轻甲状腺肿大程度、恢复甲状腺功能、控制炎症(血沉)反应,且甲减发生率和SAT复发率均较低。经过Meta分析验证,基于“火郁发之”理论下的“升阳清热”法是治疗SAT有效、安全的治疗方法。3“升阳清热”法能够抑制腺病毒致Nthy-roi3-1细胞感染的焦亡过程,其机制主要与下调焦亡上游调控分子ELAVL1表达和转录水平,抑制NLRP3炎症小体活化、下调Caspase-1活化水平、抑制炎性细胞因子IL-1β、IL-18表达和GSDMD-N的表达有关。