藏药小檗皮DNA条形码鉴定及质量控制研究

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小檗皮为常用藏药材,始载于《四部医典》,藏文译音“吉尔哇”、“杰星”、“给尔驯”等。《晶珠本草》记载:“小檗皮性凉、糙,能敛诸毒,干黄水”。小檗皮具有清热、解毒、燥湿、排黄水等功效,可用于痢疾、尿路感染、黄水病、眼病等疾病的治疗。现代药理学研究表明,小檗皮具有明显的降糖作用,对糖尿病大鼠视网膜具有较好的保护作用,应用前景广阔。然而,小檗皮为典型的多基原藏药材,品种繁多,小檗属(Berberis L.)多种药用植物均被使用,基原的多样性和复杂性严重影响小檗皮药材的质量控制和市场监管。因此,采用现代科学技术对小檗皮药材进行准确鉴定和质量评控,有利于正本清源,遏制药材的混淆代用,并提高其质量控制水平,从而改变目前藏药小檗皮药材品种混乱、质量控制不力的现状,促进药材使用的安全性、有效性和质量可控性。  目的:  1.建立藏药小檗皮DNA条形码鉴定方法;  2.建立同时测定小檗皮中4种有效成分的HPLC含量测定方法;  3.建立藏药小檗皮药材的质量标准,提高质量控制水平。  方法:  1.采用不同DNA条形码候选序列(ITS、ITS2和rbcL)对藏药小檗皮主流品种刺红珠Berberis dictyophylla Franch.、甘肃小檗B.kansuensis Schneid.、鲜黄小檗B.diaphana Maxim.、匙叶小檗B.vernae Schneid.进行鉴定,通过比较PCR扩增效率、测序成功率以及种内种间变异,评价各序列对小檗皮不同基原植物的鉴别能力。其次,利用候选序列对小檗皮商品药材进行基原鉴别,从而评价DNA条形码在小檗皮药材基原鉴定中的可行性、稳定性和准确性,最终筛选出最佳条形码序列。  2.采用HPLC-DAD法同时测定藏药小檗皮中木兰花碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的含量;参照《中国药典》2015年版附录相关方法,测定小檗皮药材的水分、灰分和浸出物的含量;以主要有效成分木兰花碱、药根碱、巴马汀、小檗碱为指标,分别采用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)进行定性鉴别和含量测定研究。  结果:  1.藏药小檗皮主流品种的鉴定:19批小檗皮样品的DNA均能成功提取,ITS序列长度为616bp,比对后发现共有9个变异位点、7种单倍型;ITS2序列长度相对较短,为253bp,比对后发现共有7个变异位点、7种单倍型;rbcL序列长度为651bp,比对后发现共有4个变异位点、4种单倍型。其中,基于rbcL序列的平均种间K2P距离均大于平均种内K2P距离,Barcoding gap和系统进化树结果表明,rbcL序列相对ITS、ITS2序列显示出更高的鉴定效率,可用于小檗皮4种主流品种的鉴定。  2.小檗皮商品药材的鉴定:(1)NCBI数据库比对结果发现,15批商品药材中有14批样品为小檗属植物,1批为黄檗属植物;(2)基于rbcL序列构建系统发育树,结果15批药材中有14批与小檗属基原植物聚为一大支,而另外1批样品单独聚为一支,与数据库比对结果一致;(3)将15批商品药材与19批基原植物的rbcL序列进行比对,发现12批商品药材的单倍型分别与4种主流品种一致,无种内变异位点,而另外3批为新增单倍型。(4)最终,结合DNA条形码鉴定系统和NCBI数据库比对结果,发现15批商品药材中3批药材为刺红珠B.dictyophylla,5批为鲜黄小檗B.diaphana,3批为甘肃小檗B.kansuensis,1批为匙叶小檗B.vernae,1批为金花小檗B.wilsonae,1批为刺檗B.vulgaris,1批为芸香科黄檗属植物黄皮树Phellodendron chinense或其近缘植物。  3.藏药小檗皮药材质量标准:确定了小檗皮性状特征和显微特征;建立了小檗皮的薄层鉴别方法;研究结果表明,小檗皮水分为8.39%~12.23%(平均值:10.50%),总灰分为4.50%~9.96%(平均值:5.77%),酸不溶性灰分为0.10%~0.69%(平均值:0.23%),浸出物为20.62%~37.13%(平均值:31.92%);小檗皮药材中木兰花碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的平均含量分别为5.98%,0.63%,0.30%,2.50%。  4.不同药用部位含量测定:匙叶小檗、甘肃小檗和鲜黄小檗的不同部位中生物碱成分含量有明显的差异(P<0.01),根内皮及茎内皮中四种生物碱成分及总生物碱含量明显高于茎木、茎栓皮、根木和根栓皮(P<0.05)。  结论:  1.基于rbcL序列的DNA条形码技术能够对藏药小檗皮4种主流品种和商品药材的基原进行鉴定,且该方法操作简单、重复性好。  2.建立的藏药小檗皮质量标准具有一定的专属性和可控性,且操作方法简单,制定的标准限度合理,可用于小檗皮的质量控制。  3.在符合藏医用药规律(内皮入药)的基础上,为了避免不合理的采挖,保护生态环境,建议今后使用小檗皮茎内皮入药,取消用根内皮。
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