背景和目的：肝细胞癌(Hepatocellμlar carcinoma, HCC)是最常见的原发性肝癌,是全球癌症相关死亡的第三大最常见原因。尽管多学科综合治疗策略已应用于肝癌治疗,但由于耐药性和术后复发,治疗结果大多仍然不理想。随着对肿瘤和干细胞的深入研究,Hamburger和Salmon等研究者率先提出了肿瘤干细胞学说。该学说认为：肿瘤组织中有极少部分的肿瘤细胞具有一些与干细胞相似的特性,如自我更新、增殖、分化等,这部分细胞所占比例不到肿瘤细胞总数的百分之一,被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs),肿瘤的形成和发展过程主要由该细胞主导。Todaro M和Liu H等研究者也证实乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、脑肿瘤等均存在CSCs。那么,肝癌组织中是否也存在着肝癌干细胞(liver cancer stem cells, LCSCs)呢?Lingala等研究者通过CD133联合醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase, ALDH)或CD44联合CD90,经免疫组化染色,证实了肝癌组织中存在LCSCs。但是LCSCs的起源仍是未知,目前主要有两种理论：一是成熟肝细胞去分化,二是肝正常干细胞(liver normal stem cells, LNSCs)分化成熟停滞。越来越多的研究发现LCSCs多来源于LNSCs分化停滞,且LNSCs在一定因素诱导下可转化为LCSCs。然而,LCSCs的发生是一个复杂且多步骤的过程,涉及了各种基因失控的积累和表型的改变,单个基因对此级联反应的作用有限。非编码RNA (non-coding RNAs, ncRNAs)在转录和翻译水平都发挥强大的调节功能,包括长链非编码RNA(Long non-coding RNAs, lncRNAs)和微小RNA (micro RNAs miRNAs)等。miRNAs(0-22nt)在转录后水平负调控基因表达,单个miRNAs通过互补配对和错配可以同时调控多分子。越来越多的研究表明,许多miRNAs在肿瘤发生和进展中发挥关键作用。lncRNAs(超过200nt)与miRNAs有着相似的生物学特性,即单个lncRNAs分子也可以调控单基因,多基因,家族基因,乃至整个染色体,而且还具备多种调节功能,如染色体剂量补偿、表观遗传调控、细胞核和细胞质物质运输、转录、mRNA拼接和翻译等,与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等生物学行为有密切的联系。正是因为具有强大的调控能力,miRNAs与lncRNAs吸引了大量研究人员来探索ncRNAs在肿瘤恶性转化中的作用。本研究团队既往的一项研究对ncRNAs在LCSCs和LNSCs间不同的表达方式进行了比较：相较LNSCs,在LCSCs中miR-200a是表达下调最多的分子之一,miR-10b是表达上调最多的分子。Geng等研究者也在HCC术后患者中发现,癌组织HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)的表达量较癌旁组织明显上升,且HOTAIR的表达量与HCC的复发和淋巴结转移关联密切,干扰HOTAIR表达后,肿瘤细胞的增殖能力明显下降。miR-10b和HOTAIR的特定基因序列都位于高度保守的HOX基因簇,并且共享上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)有关目标基因的相似靶点,如HOXD10。然而,miR-10b和HOTAIR在恶性转化过程中的作用仍未知。在本研究中,我们通过增强HOTAIR或miR-10b在LNSCs的表达水平,来观察LNSCs向LCSCs表型恶性转化的可能性,并探索HOTAIR或miR-10b在LNSCs恶性转化进程中的作用及其调控机制,以期为LCSCs来源于分化停滞的LNSCs这一理论补充新的证据,并为HCC治疗寻找新靶点。方法：采用慢病毒转染原代培养的大鼠LNSCs,通过增强miR-10b或HOTAIR表达水平,对增高前后LNSCs增殖、凋亡、迁移和成瘤特性进行了观察比较,并初步探讨诱导LNSCs恶性转化的机制。1.细胞收集和培养利用CCL4建立大鼠肝损伤模型,切取肝脏后,采用非连续密度梯度法收集LNSCs。并根据实验要求分为miR-10b表达增强组、HOTAIR表达增强组、野生型LNSCs组。2.细胞慢病毒转染HOTAIR cDNA插入到哺乳动物表达载体pcDNA3.1;采用X-Press Plasmid DNA Mini Kit提取用于转染的所有质粒载体；并根据Lipofectamine2000说明书,将pre-miR-10b前体(50nm)和pCDNA/HOTAIR分别形成DNA-Lipofectamine 2000复合物,将复合物转染293T细胞,扩增培养并破解293T细胞收集含有目标基因的慢病毒,最后通过浓缩的慢病毒感染靶细胞LNSCs。3.细胞增殖能力检测采用MTT法测定细胞增殖能力。各组细胞以1×104细胞／孔的浓度接种到96孔板中。通过1,2,3,4,5,6和7天的培养,添加终浓度为5mg/ml的MTT 20μL到每个孔,在室温下孵育4h,然后用150μ二甲基亚砜(Dimethyl sμlfoxide, DMSO)溶解晶体,用Bio-Rad 680酶标仪在波长490 nm测定光密度。4.细胞凋亡和细胞周期检测流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。各组细胞用冷的75%(v/v)乙醇固定48 h,PBS洗一次,1000rpm离心10 min,随后0.01%RNA酶室温处理30 min。用PI孵育后(0.1mg/L),每样10000细胞进行流式细胞检测。采用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒对细胞凋亡进行检测。每组共收集2.5×106个细胞,用冷PBS洗涤,荧光素标记的Annexin V和PI孵育15 min,并用流式细胞仪检测。PI阴性、Annexin-V阳性细胞被认为是在早期凋亡状态,而PI和Annexin V均是阴性的为非凋亡细胞。5.细胞标志物检测免疫荧光法检测细胞标志物。细胞爬片用4%多聚甲醛在室温下固定15 min,然后用含有二抗物种特异血清的PBS在室温下封闭30min。用抗-AFP鼠多克隆抗体(IgG)(1：1000)和抗CK 19小鼠多克隆抗体(IgG)(1：1000)在4℃孵育,然后用PBS洗涤,加入FITC标记的二抗体孵育。6.细胞迁移能力检测迁移实验检测细胞迁移能力。将1×105个细胞接种于0.5m1的无血清培养基,置于8mm孔径的聚碳酸酯膜的Boyden小室,插入Transwell装置中。将含有20%胎牛血清的Williams’E培养基置入下室。在37℃培养24h后,迁移至底部的细胞用100%甲醇固定2 min,0.5%结晶紫染色2 min,用PBS洗涤,并通过显微镜进行检测。随机选择高倍视野计数迁移的细胞。7.体内成瘤实验每组1×107个细胞注射到裸鼠皮下相同部位。注射60d后处死裸鼠,观察肝组织形态结构,并用石蜡包埋肝组织,HE染色检测。8.实时荧光定量PCR检测mRNA水平RNA根据说明书利用Invitrogen公司Trizol提取。利用PrimeScript RT试剂盒合成cDNA。PCR特异性引物如下：E-cadherin(F:5’-GATGTGGCTCCCACCCTCATG-3’R: 5’-CTTCTTGAACCGGTTGCCCCA-3’),内参GAPDH(F:5’-ATGGTGGTGAAGACGC CAGTA-3’R:5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG 3’). PCR反应如下：95℃变性lmin,60℃退火1 min,72℃延伸2min(共计35次),72℃额外延伸10min。对照组采用水代替cDNA。扩增产物利用3%琼脂糖凝胶电泳检测。大鼠GAPDH作为内参基因。9. Western-blot检测蛋白水平细胞利用含有的蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液进行裂解。裂解物在4℃、10000 rpm离心10 min。蛋白质浓度的定量采用以牛血清白蛋白作为标准蛋白的Bradford方法。总量50μg蛋白样品用10%SDS-PAGE跑胶,并转膜至PVDF膜。PVDF膜用5%脱脂牛奶在室温下封闭2h,抗E-钙粘蛋白(1：200)或抗GAPDH (1:1000)在4℃孵育过夜。TBST洗涤3次,每次5min。过氧化物酶标记的羊抗鼠／兔IgG或过氧化物酶标记的兔抗羊IgG在室温下孵育2h。结果：1. miR-10b或HOTAIR表达增强后LNSCs增殖能力增强慢病毒转染后的头3天,miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组细胞增殖都比较缓慢,这段时期所有的细胞都被认为处于潜伏期。第4天开始,miR-10b和HOTAIR表达增强组LNSCs细胞数远高于野生型LNSCs组。第3天至第5天,miR-10b和HOTAIR表达增强组LNSCs细胞均进入对数生长期,比野生型LNSCs有着显著更高的增殖速度和更短的倍增时间。miR-10b和HOTAIR表达增强组之间在增殖能力方面没有观察到显著差异。实验结果表明：miR-10b或HOTAIR表达增强后细胞增殖能力增强。2. miR-10b或HOTAIR表达增强后LNSCs在S和G2/M期的细胞增多,凋亡减少各组的大部分细胞处于G1期。野生型LNSCs组,约12%的细胞处于G2/M期,4%处于S期。miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组分别约19%和23%的细胞处于G2/M期,约14%和17%的细胞分别处于S期。实验结果表明：miR-10b或HOTAIR的表达增强能显著减少处于细胞周期G0/G1期的细胞比例,增加处于S和G2/M期的细胞比例。在野生型LNSCs组、miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组中,坏死细胞比率分别约为9%,7%和2%,细胞凋亡率分别为11%,9%和2%。实验结果表明：miR-10b或HOTAIR表达增强后细胞抗凋亡能力显著提高。3. miR-10b或HOTAIR表达增强对AFP、CK19产生影响随着niR-10b和HOTAIR表达增强后LNSCs的恶性转化,甲胎蛋白AFP表达上调,而胆管细胞的标记CK19表达逐渐消失。miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组AFP的特定表达水平分别比野生型LNSCs组高3.1倍和2.9倍。实验结果表明：LNSCs恶性转化的趋势是肝细胞癌,而不是胆管细胞癌。4. miR-10b或HOTAIR表达增强后LNSCs获得更强的迁移能力在相同的培养条件下,miR-10b或HOTAIR表达增强的LNSCs比野生型LNSCs具有明显更高的穿膜力。miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组阳性细胞数相近。实验结果表明：miR-10b或HOTAIR表达增强后,细胞具有更强的迁徙特性。5. miR-10b或HOTAIR表达增强后LNSCs出现归巢倾向各组在皮下注射的位置均没有实体瘤的形成,但是miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组观察到了严重的肝损伤和炎症,这提示恶性转化的LNSCs具有归巢趋势。H&E染色结果表明,miR-10b或HOTAIR表达增强后可导致肝组织严重坏死,炎症细胞浸润。皮下注射HOTAIR表达增强的LNSCs的小鼠肝脏出现肝硬化迹象。6. miR-10b或HOTAIR表达增强后E-钙粘蛋白表达下调为了探讨miR-10b或HOTAIR表达增强后LNSCs获得恶性表型且归巢趋势明显增强的分子机制,我们对两种非编码RNA的潜在靶点E-钙粘蛋白的表达水平进行了检测,实验结果表明：E-钙粘蛋白在mRNA水平和蛋白质水平表达均下调。通过生物信息数据库预测到miR-10b和E-钙粘蛋白之间可能有相互作用。实验证实了两者间存在相互作用,也正是由于这种相互作用,造成了E-钙粘蛋白的降解,发生EMT过程,并最终导致恶性表型和归巢的倾向。结论：1.发现了非编码RNA中miR-10b和HOTAIR参与了肝正常干细胞向肝癌干细胞恶性转化的过程；2.发现了增强miR-10b或HOTAIR表达水平能够诱导肝正常干细胞出现肝癌干细胞的一系列恶性表型,如增殖加快、凋亡减少、迁移能力增强,并出现归巢倾向；3.初步证明了miR-10b或HOTAIR可以通过下调E-钙粘蛋白和诱导EMT发生,促使肝正常干细胞发生恶性转化。