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目的:糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的一种重要微血管病变并发症。对于糖尿病患者来说,DR也是导致他们视力下降甚至失明的主要原因。近来对DR并发症进行了深入的研究。研究发现了一种特殊的代谢记忆现象,这种现象是指患者经历一段时间的高血糖状态,血糖水平恢复正常后,血管并发症仍然高发的现象。对于DR患者来说,高糖代谢记忆现象可能是血糖控制后病情继续进展的重要原因。既往研究表明,由内源性和外源性来源引起的氧化应激会对包括基因组和线粒体DNA在内的细胞成分造成损害。DR患者视网膜血管存在mtDNA损伤,且有氧化应激引发的ROS过量产生参与DR早期发病。mtDNA一旦受损,将会导致线粒体膜电位降低,细胞凋亡增加,反过来又增加了ROS的产生,并形成ROS过量产生的恶性循环。由于代谢性记忆现象是DR过程中难以克服的现象,我们推测ROS过量产生的这种恶性循环不断促进代谢性记忆的过程,导致视网膜血管mtDNA氧化损伤。
为了更好地了解高糖代谢记忆现象对DR线粒体氧化损伤的影响,我们使用hRECs体外模拟代谢记忆。将hRECs暴露于高糖环境中作用不同时间后再转至正常培养基培养2天,分别检测hRECsmtDNA氧化损伤的变化及其对视网膜血管内皮细胞细胞功能障碍的影响。从mtDNA氧化损伤角度明确DR代谢记忆,并通过各组对比观察,探讨mtDNA氧化损伤通过“ROS过量产生的恶性循环”启动代谢记忆、推动DR进程的可能性。
方法:(1)传代培养的第3-10代hREC细胞(hRECs)分4组,(1)空白对照组,5.5mmol/LDMEM低糖培养基培养;(2)高糖诱导3h组,用30mmol/l的DMEM高糖培养基处理hREC细胞3h后,再转移至5.5mmol/LDMEM低糖培养基中培养2d,构造高糖“代谢记忆”细胞模型;(3)高糖诱导12h组,用30mmol/l的DMEM高糖培养基处理hREC细胞12h后,再转移至5.5mmol/LDMEM低糖培养基中培养2d;(4)高糖诱导24h组,用30mmol/l的DMEM高糖培养基处理hREC细胞24h后,再转移至5.5mmol/LDMEM低糖培养基中培养2d;2d结束时在电镜下观察细胞形态并收集细胞采用流式细胞术检测细胞凋亡率,从细胞功能方面检测氧化损伤。
(2)通过蛋白质印迹法检测hRECs线粒体细胞色素c的释放,检测代谢记忆作用下hREC细胞线粒体功能氧化损伤变化。
(3 )通过实时定量PCR检测并观察线粒体内呼吸链复合物COX-1,NADPH两种蛋白的表达变化,以描绘高糖“代谢记忆”细胞模型中线粒体功能的氧化损伤。
(4)收集各高糖诱导组细胞,用流式细胞术检测hREC细胞线粒体ROS的产生,检测hRECs细胞线粒体功能的氧化损伤。
(5)通过JC-1检测各代谢记忆组线粒体膜电位的改变,检测hRECs细胞线粒体功能的氧化损伤。
(6)通过酶联免疫吸附实验检测hREC细胞线粒体内8-OHdG水平,其是线粒体氧化损伤标志物,以观察各高糖诱导组hRECs细胞线粒体DNA的氧化损伤的变化
结果:(1)高糖“代谢记忆”细胞模型中,ROS的产生量以时间依赖性方式持续升高。DCFH-DAROS测定结果显示,对照组细胞ROS产生量为1.96%,高糖诱导3h组,ROS增加到8.53%,高糖诱导12h组ROS进一步增加到13.01%,呈持续升高趋势(P<0.05)。高糖诱导24h组ROS比例上升到了20.12%(P<0.05)。即使转移至正常葡萄糖培养基培养2d,ROS的产生仍然不断增加,即“高糖损伤”解除后氧化损伤仍可持续存在,细胞功能持续损伤
(2)AnnexinV/PI流式细胞术显示:高糖诱导24h组凋亡率高于高糖诱导12h组,高糖诱导12h组凋亡率高于高糖诱导3h组(P<0.05),且均高于对照组(P<0.05),细胞功能持续损伤。
(3)RT-qPCR检测hRECs线粒体内呼吸链复合物COX1,NADPHmRNA的表达:各代谢记忆组hRECs线粒体内呼吸链复合物COX1,NADPHmRNA的表达量持续下调,各高糖诱导组hRECs细胞线粒体DNA功能持续损伤(P<0.05)
(4)与正常对照组相比,各高糖诱导组细胞线粒体内细胞色素C释放增多(P<0.05),各高糖诱导组hRECs线粒体功能持续损伤。
(5)与正常对照组比较,各高糖诱导组hRECs线粒体膜电位随着时间梯度持续受损,膜电位逐渐下降,且有明显统计学差异(P<0.05),线粒体功能持续损伤。
(6)与正常对照组相比,hRECs线粒体内8-OHdG氧化应激水平随着时间不断升高(P<0.05),线粒体DNA氧化损伤状态持续进行。
结论:高糖下视网膜血管线粒体DNA氧化损伤可能是“高糖损伤”解除后氧化损伤可持续存在的“源动力”
为了更好地了解高糖代谢记忆现象对DR线粒体氧化损伤的影响,我们使用hRECs体外模拟代谢记忆。将hRECs暴露于高糖环境中作用不同时间后再转至正常培养基培养2天,分别检测hRECsmtDNA氧化损伤的变化及其对视网膜血管内皮细胞细胞功能障碍的影响。从mtDNA氧化损伤角度明确DR代谢记忆,并通过各组对比观察,探讨mtDNA氧化损伤通过“ROS过量产生的恶性循环”启动代谢记忆、推动DR进程的可能性。
方法:(1)传代培养的第3-10代hREC细胞(hRECs)分4组,(1)空白对照组,5.5mmol/LDMEM低糖培养基培养;(2)高糖诱导3h组,用30mmol/l的DMEM高糖培养基处理hREC细胞3h后,再转移至5.5mmol/LDMEM低糖培养基中培养2d,构造高糖“代谢记忆”细胞模型;(3)高糖诱导12h组,用30mmol/l的DMEM高糖培养基处理hREC细胞12h后,再转移至5.5mmol/LDMEM低糖培养基中培养2d;(4)高糖诱导24h组,用30mmol/l的DMEM高糖培养基处理hREC细胞24h后,再转移至5.5mmol/LDMEM低糖培养基中培养2d;2d结束时在电镜下观察细胞形态并收集细胞采用流式细胞术检测细胞凋亡率,从细胞功能方面检测氧化损伤。
(2)通过蛋白质印迹法检测hRECs线粒体细胞色素c的释放,检测代谢记忆作用下hREC细胞线粒体功能氧化损伤变化。
(3 )通过实时定量PCR检测并观察线粒体内呼吸链复合物COX-1,NADPH两种蛋白的表达变化,以描绘高糖“代谢记忆”细胞模型中线粒体功能的氧化损伤。
(4)收集各高糖诱导组细胞,用流式细胞术检测hREC细胞线粒体ROS的产生,检测hRECs细胞线粒体功能的氧化损伤。
(5)通过JC-1检测各代谢记忆组线粒体膜电位的改变,检测hRECs细胞线粒体功能的氧化损伤。
(6)通过酶联免疫吸附实验检测hREC细胞线粒体内8-OHdG水平,其是线粒体氧化损伤标志物,以观察各高糖诱导组hRECs细胞线粒体DNA的氧化损伤的变化
结果:(1)高糖“代谢记忆”细胞模型中,ROS的产生量以时间依赖性方式持续升高。DCFH-DAROS测定结果显示,对照组细胞ROS产生量为1.96%,高糖诱导3h组,ROS增加到8.53%,高糖诱导12h组ROS进一步增加到13.01%,呈持续升高趋势(P<0.05)。高糖诱导24h组ROS比例上升到了20.12%(P<0.05)。即使转移至正常葡萄糖培养基培养2d,ROS的产生仍然不断增加,即“高糖损伤”解除后氧化损伤仍可持续存在,细胞功能持续损伤
(2)AnnexinV/PI流式细胞术显示:高糖诱导24h组凋亡率高于高糖诱导12h组,高糖诱导12h组凋亡率高于高糖诱导3h组(P<0.05),且均高于对照组(P<0.05),细胞功能持续损伤。
(3)RT-qPCR检测hRECs线粒体内呼吸链复合物COX1,NADPHmRNA的表达:各代谢记忆组hRECs线粒体内呼吸链复合物COX1,NADPHmRNA的表达量持续下调,各高糖诱导组hRECs细胞线粒体DNA功能持续损伤(P<0.05)
(4)与正常对照组相比,各高糖诱导组细胞线粒体内细胞色素C释放增多(P<0.05),各高糖诱导组hRECs线粒体功能持续损伤。
(5)与正常对照组比较,各高糖诱导组hRECs线粒体膜电位随着时间梯度持续受损,膜电位逐渐下降,且有明显统计学差异(P<0.05),线粒体功能持续损伤。
(6)与正常对照组相比,hRECs线粒体内8-OHdG氧化应激水平随着时间不断升高(P<0.05),线粒体DNA氧化损伤状态持续进行。
结论:高糖下视网膜血管线粒体DNA氧化损伤可能是“高糖损伤”解除后氧化损伤可持续存在的“源动力”