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昆虫细胞-杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System,BEVS)是近年来发展迅速的真核细胞表达系统,在基因工程、蛋白工程、工程疫苗、药物研究和开发、生物农药等领域具有重要的应用价值。本文以来源于鳞翅目(Lepidoptera)凤蝶科(Papilionidae)的达摩凤蝶Papilio demoleus Linnaeus的4个细胞系(RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2、RIRI-Pa De-3、以及RIRI-Pa De-4)作为试验材料,采用不同的单细胞培养技术对其进行细胞克隆,通过对不同克隆方法进行比较,建立了一套适用于达摩凤蝶细胞系的克隆方法;对获得的达摩凤蝶细胞系及克隆株细胞的蛋白表达特性进行研究比较,筛选出了蛋白表达水平显著高于原细胞系的克隆株,并对克隆株的基础生物学特性进行了较详尽的研究。达摩凤蝶细胞克隆株的建立不仅为其他昆虫细胞系克隆提供一种新的单细胞克隆手段,也为达摩凤蝶细胞系高水平表达克隆株的后续利用奠定基础。主要的研究结果如下:1、达摩凤蝶细胞系克隆株的建立使用有限稀释法、显微操作法,饲养层培养法,以及半固体培养法对4个达摩凤蝶细胞系进行单细胞克隆,结果证明,仅有半固体培养法能够从原细胞系中获得亚克隆。当半固体培养基中的细胞接种密度为3.05×105~6.10×105个/m L时,单颗细胞容易增殖形成克隆斑,且克隆斑之间保持合适距离,挑取克隆斑转移至液体培养基继续培养。当细胞斑适应培养环境后,细胞增殖明显并进行扩增,最终得到稳定遗传的克隆株细胞,整个克隆过程需要41~64 d的时间。使用半固体培养法对达摩凤蝶细胞进行克隆,共获得61个克隆株细胞,其中RIRI-Pa De-1获得6个克隆株,RIRI-Pa De-2获得11个克隆株,RIRI-Pa De-3获得40个克隆株,RIRI-Pa De-4获得4个克隆株。2、达摩凤蝶克隆株细胞中的外源蛋白表达使用3种重组杆状病毒(绿色荧光杆状病毒Ac MNPV-GFP、β-半乳糖苷酶杆状病毒Ac MNPV-Gal、分泌型碱性磷酸酶杆状病毒Ac MNPV-SEAP)分别对4个达摩凤蝶细胞系(RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2、RIRI-Pa De-3、RIRI-Pa De-4)及其克隆株细胞进行侵染,观察供试细胞系对重组病毒的反应,检测重组蛋白在各细胞系中的表达水平。(1)GFP在4个达摩凤蝶细胞系及其克隆株细胞中的表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)能够在细胞系RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-3及其部分克隆株细胞中表达,且在原细胞系中的表达水平均高于其克隆株,其中RIRI-Pa De-3在感染Ac MNPV-GFP 120 h时,培养细胞中发绿色荧光细胞数目最多,但仍低于Sf9(1260.667±88.636个/孔)。细胞系RIRI-Pa De-2和RIRI-Pa De-4及其克隆株均不能表达GFP。(2)β-半乳糖苷酶在3个达摩凤蝶细胞系及其克隆株细胞中的表达Ac MNPV-Gal均能感染3个达摩凤蝶细胞系及其克隆株细胞,但β-半乳糖苷酶(β-galactosidase enzyme,β-Gal)在供试细胞系中的表达水平存在一定差异。其中克隆株细胞RIRI-Pa De-1-C1对β-Gal的表达水平显著高于原细胞系RIRI-Pa De-1;克隆株细胞RIRI-Pa De-2-C6对β-Gal的表达水平是原细胞系RIRI-Pa De-2的2倍;在所有供试细胞中,RIRI-Pa De-3-C52对β-Gal的表达水平最高(0.270±0.009 milliunits/μL),与原细胞系相比RIRI-Pa De-3无显著差异,远少于Sf9(Spodoptera frugiperda 9)的表达水平(4.132±0.941 milliunits/μL)。(3)分泌型碱性磷酸酶在3个达摩凤蝶细胞系及其克隆株细胞中的表达Ac MNPV-SEAP均能感染3个达摩凤蝶细胞系及其克隆株细胞,但分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)在供试细胞系中的表达水平存在一定差异。其中RIRI-Pa De-1细胞系对SEAP的表达水平与其克隆株细胞无显著差异(P>0.05);在RIRI-Pa De-2的克隆株细胞中未能筛选出表达水平高于原细胞系的细胞;RIRI-Pa De-3的克隆株细胞对SEAP的表达水平均显著小于原细胞系(P<0.05)。3、RIRI-Pa De-2-C6的生物学特性研究通过对4个达摩凤蝶细胞系及其克隆株细胞的蛋白表达特性进行研究,发现克隆株RIRI-Pa De-2-C6对β-Gal的表达水平显著高于原细胞系RIRI-Pa De-2。我们对其基础生物学进行了研究。在细胞形态学方面,克隆株细胞RIRI-Pa De-2-C6的细胞类型组成全部为梭形细胞,较原细胞系RIRI-Pa De-2更加简单;在倍增时间上,RIRI-Pa De-2-C6的细胞群体倍增时间为94.94 h,较原细胞系RIRI-Pa De-2的倍增时间67.42 h长;在染色体数目上,RIRI-Pa De-2-C6的染色体平均数目数目是52.26±30.48条,与RIRI-Pa De-2的染色体平均数目73.19±24.27条存在显著差异(P<0.05);病毒敏感性研究表明,RIRI-Pa De-2-C6细胞对Ac MNPV的敏感性高于RIRI-Pa De-2。综上所述,本文使用4种单细胞克隆技术对4个达摩凤蝶细胞系进行克隆,最终使用半固体培养配合显微操作系统的方法成功从达摩凤蝶细胞系中获得61个克隆株,其中RIRI-Pa De-2-C6对β-Gal的表达水平较原细胞系RIRI-Pa De-2高1倍,具有进一步研究的价值。同时我们对RIRI-Pa De-2-C6的基础生物学特性进行较为详尽的研究,为其进一步开发利用奠定基础。