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纤维素是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，是自然界中数量最大的可再生性物质。但绝大部分纤维素没有被利用，在资源浪费的同时，还造成了环境污染。如能利用微生物生产的纤维素酶将这些纤维素资源彻底降解，转化为人类急需的能源、食物和化工原料，对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。而传统的原始菌发酵产纤维素酶己不能满足生产的需要，怎样利用基因工程的手段来改造和利用纤维素酶，是摆在我们面前一个极富挑战的课题。本论文重点研究了里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的克隆与表达，并对其表达条件进行了初步的优化，具体工作如下：
本论文以里氏木霉为出发菌株，通过RT-PCR技术获得三个纤维素酶基因，对应的编码蛋白分别为来自里氏木霉T.reesei QM9414的内切葡聚糖酶基因EGI，来自里氏木霉T.reesei QM9414和T.reesei Rut C-30的外切葡聚糖酶同源基因TQ4(CBHI)和TR4(CBHI)。将三个基因分别克隆到pGEM-T载体上，经测序和分析表明，编码基因对应的氨基酸序列除TQ4(CBHI)发生碱基缺失导致氨基酸序列不完整外，其他2条基因EGI和TR4(CBHI)的序列正确与Genbank公布数据略有差异。利用PCR方法对碱基缺失突变的外切葡聚糖酶基因TQ4(CBHI)进行了回复突变，成功获得了完整的基因全序列，并将该基因克隆到PMD18-T载体。
将里氏木霉纤维素酶基因-内切葡聚糖酶基因EGⅠ、外切葡聚糖酶同源基因TQ4-total(CBHI)和TR4(CBHI)分别构建到组成型表达载体pYX212上，转化至酿酒酵母YPH499菌株，在TPI(磷酸丙糖异构酶)启动子的调控下、酶自身信号肽序列引导下进行分泌表达。酶活测定表明转入酿酒酵母的纤维素酶得到了活性表达，发酵84 h的重组酵母YPP499-pYX-EGⅠ的内切葡聚糖酶CMC-Na酶活力为0.154IU/mL，YPP499-pYX-TQ4-total(CBHⅠ)和YPP499-pYX-TR4(CBHⅠ)的外切葡聚糖酶pNPL酶活力分别为0.031 IU/mL和0.028 IU/mL。
研究和分析了酶活测定条件对EGⅠ酶活力的影响。结果表明，测定EGⅠ酶活力的最适条件为：以1 mL1％(w/v)CMC-Na溶液为底物，酶液用量为1 mL时，酶促反应30 min，DNS显色5 min，于550 nm处测定吸光度OD值比较适宜，EGⅠ的最适反应温度和pH分别为50℃和4.8。通过发酵表达条件的优化，确定了重组酵母分泌表达EGⅠ酶活力的最佳培养时间为84 h，最适碳源为2％葡萄糖，最适发酵温度为30℃，最适起始发酵pH为5.0，最适发酵转速为230 r/min，经过发酵优化后的最高实测酶活达到0.173 IU/mL，比优化前提高了12.3％。