背景:肝细胞肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤,是我国第四常见的恶性肿瘤,也是导致癌症相关死亡的第三大原因,严重威胁人民群众生命健康。临床上,晚期肝癌患者往往没有很好的治疗办法。肝癌对放化疗的治疗效果都理想,这使得靶向治疗成为晚期肝癌治疗中尚可以尝试的治疗手段。近年来,肝癌的靶向药物治疗方法开发取得了不少进展。但靶向药物治疗过程中,耐药问题的发生却成为一个新的难题。在过去十多年中,索拉非尼是唯一批准应用于晚期肝癌治疗的靶向药物,它能显著延长患者生存时间,延缓肿瘤进展。但同时,索拉非尼应用过程中,药物耐药产生的几率也非常高,极大地限制了其临床应用效果。关于索拉非尼耐药发生的机制的既往研究有很多报道。但其发生的具体机制尚不十分明确。micro RNAs通过调节蛋白转录后表达,参与了许多生物过程的调控。而在索拉非尼耐药的发生发展过程中,是否有micro RNAs的参与,需要进一步研究。实验方法:首先,我们建立了索拉非尼耐药的肝癌细胞系,作为研究的体外模型。采用micro RNA测序,q PCR验证等实验手段,分析索拉非尼耐药过程中,存在差异表达的micro RNAs。其次,采用CCK-8筛选其中发挥功能,参与耐药发生的micro RNAs,并使用在线临床数据验证该micro RNA的功能。随后,采用micro RNAmimics转染及CRISPR-CAS9技术分别在耐药及野生细胞系中,增加或降低miR-486-3p的表达,来探究其生物学功能。采用FITC-Annexin V/PI流式凋亡检测、TUNEL凋亡检测等方法评估增加miR-486-3p水平对凋亡的影响。采用实时无标记细胞分析仪评估降低miR-486-3p水平对索拉非尼药物作用的影响。网络数据库被用于预测miRNA下游可能作用靶点。采用Western Blot及q PCR手段,分析、验证miR-486-3p下游作用靶点。采用双荧光素酶报告实验分析并验证miR-486-3p在FGFR4和EGFR 3’UTR上的结合位点。我们构建了小鼠肝癌索拉非尼耐药模型,作为研究的体内模型。通过该动物模型,采用免疫组化、TUNEL凋亡检测等手段,验证miR-486-3p在体内的作用及作用机制。另外,在体内实验和体外实验中,EGFR的特异性抑制剂吉非替尼和FGFR4的特异性抑制剂GLU9931都被用来验证EGFR和FGFR4在索拉非尼耐药发生机制中的重要作用。实验结果:通过培养基中索拉非尼长期诱导,我们成功建立了3株索拉非尼耐药的肝癌细胞系:Huh7-SR,SK-Hep-SR,Hep G2-SR。micro RNA测序结果提示,与野生型肝癌细胞相比,耐药细胞中,存在26个表达量发生显著差异的micro RNAs:其中miR-671-3p、miR-378a-5 p、miR-328-3p、miR-486-3p和miR-378a-3p水平在耐药细胞中显著降低。经q PCR验证和CCK-8细胞增殖实验,我们发现miR-486-3p水平在耐药细胞中显著降低,增加miR-486-3p表达能显著抑制索拉非尼的耐药水平。这提示miR-486-3p参与索拉非尼耐药的形成。同时,网络临床数据库Kaplan Meier-Plotter支持miR-486-3p水平与肝癌患者预后显著正相关。本中心临床数据分析也提示,miR-486-3p表达水平在肝癌肿瘤组织中,较癌旁组织显著降低。探究miR-486-3p作用机制的基础实验中,我们发现,增加miR-486-3p能显著促进索拉非尼诱导的肿瘤细胞凋亡;而通过CRISPR-CAS9方法降低miR-486-3p水平可以增加肿瘤细胞对索拉非尼的耐受性。通过网络数据库分析预测,发现miR-486-3p可能可以通过调节EGFR、FGFR4或PDGFRα发挥作用。为了验证该预测,我们采用Western blot实验发现在耐药细胞中,miR-486-3p可以显著抑制EGFR及FGFR4的表达。而且EGFR的特异性抑制剂吉非替尼、FGFR4的特异性抑制剂GLU9931都可以用于增强索拉菲尼在耐药细胞中的作用。然后,结合网络数据库的预测结果,我们采用双荧光素酶报告实验发现,EGFR和FGFR4的3’UTR序列上各存在一个miR-486-3p的结合位点发挥作用。动物实验部分,我们构建了小鼠肝癌索拉非尼耐药的动物模型。结果发现通过慢病毒瘤周注射增加miR-486-3p水平可以抑制肿瘤生长。另外,动物实验还发现,吉非替尼,GLU9931可以增加索拉非尼对耐药肿瘤中的作用,进一步说明EGFR及FGFR4的异常表达在索拉非尼耐药形成中的重要性。结论:在肝癌索拉非尼耐药产生过程中,miR-486-3p在细胞中的水平明显下降。miR-486-3p通过调控EGFR和FGFR4的表达,影响肝癌索拉非尼耐药的发生过程。探究miRNA在肝癌索拉非尼耐药中的作用有助于开发新的药物,改善临床耐药情况。