我国肝癌死亡率位居恶性肿瘤死亡率第二位,死于肝癌者占全球肝癌死亡人数的53%。几十年来,肝癌的临床诊治及基础研究均取得了丰硕成果,但其总体预后并未得到显著改善,难以早期诊断而失去手术时机是重要原因之一。血清组分变化可充分反映机体生理、病理过程,容易获取并易于监测,故一直是筛选疾病诊断标记物的最佳研究对象。目前常用的肝癌血清标记物主要为甲胎蛋白、异常凝血酶原及一些酶类,但其仍未能完全满足临床需求,为此筛选新的肝癌血清标记物仍十分必要。 按形成机理及本身性质的不同,肿瘤血清标记物可分为两大类:一类是肿瘤刺激机体免疫而产生的抗体。另一类是肿瘤衍生的与肿瘤发生发展密切相关的蛋白标记分子。二者常需采用不同的技术进行研究。 当前蛋白质组学(Proteomics)已成为后基因组时代生物学研究新的热点,其定义为:研究一个细胞、组织或完整机体在某一特定时、空条件下全部蛋白质的表达及其相互作用方式。其特点是采用高分辨率的蛋白分离手段和高通量的蛋白鉴定技术,全景式地研究各种特定情况下的蛋白表达谱。而不断发展、完善的蛋白质组学技术正逐渐成为现代生物医学研究新的强有力工具。针对上述两大类肿瘤血清标记物的不同特点,本课题拟尝试蛋白质组学中的血清蛋白组分析技术(SERPA)和双向电泳—质谱技术(2-DE—Ms)分别筛选肝癌血清中的肿瘤相关抗体及肿瘤标记蛋白,探讨蛋白质组学技术筛选肝癌血清标记物的可行性,同时对筛选出的潜在肝癌血清标记物进行初步的验证。 第一部分 SERPA技术筛选肝癌抗原及抗体 本研究的目的是通过优化双向电泳及免疫印迹技术建立稳定的SERPA技术平台并利用该平台筛选、鉴定肝癌抗原及抗体。 首先通过比较不同的蛋白定量方法、双向电泳细胞裂解液、泡胀液、等电聚焦程序及凝胶染色方法而优化双向电泳技术平台。优化后双向电泳图谱的质量有明显的改善:图谱蛋白点数明显增多(513 vs 401),图谱分辨率提高,水平条带及纵向拖尾亦明显减少。同时,2-DE的重复性也有大幅提高:对不同批次的三张双向电泳图谱进行图像分析与匹配,三张图谱的蛋白点数分别为483、525