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目的：
糖尿病缺血性疾病是糖尿病并发症之一，严重威胁人类健康与患者的生存质量。促进血管新生是治疗糖尿病缺血性疾病的有效策略。内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是内皮细胞的前体细胞，在血管生成中发挥重要作用。给裸鼠移植经体外扩增的外周血、脐带血或骨髓来源的EPCs能有效促进缺血后肢、缺血心脏的血管再生。但糖尿病患者外周循环中EPCs数量减少、功能受损，是糖尿病患者血管生成障碍、缺血性疾病发病的重要诱因。成纤维细胞生长因子21（Fibroblast Growth Factor21，FGF21）是FGF家族成员，在调节糖脂代谢中起关键作用，有治疗糖尿病及糖尿病心肌病并发症的潜力，但其对糖尿病缺血性疾病是否具有改善作用尚有待研究。
本课题利用1型糖尿病小鼠后肢缺血（Hind Limb Ischemia，HLI）模型考察FGF21是否具有治疗糖尿病缺血性疾病的潜能，在此基础上，利用体外高糖（HG）处理模拟糖尿病环境，探索FGF21是否能够保护EPCs功能。探索FGF21治疗糖尿病HLI可能的分子机制，进而为治疗糖尿病缺血性血管疾病提供新的思路。
方法：
1.采用STZ五次小剂量（50mg/kg.d）注射构建1型糖尿病小鼠，利用1型糖尿病小鼠构建糖尿病HLI模型并给予FGF21治疗，通过激光多普勒血流灌注成像分析仪（Laser Doppler Perfusion Image，LDPI）检测1型糖尿病小鼠缺血后肢血流灌注量的恢复情况进而考察FGF21的治疗作用。
2.利用免疫荧光技术检测1型糖尿病小鼠缺血部位新生血管密度。
3.利用Western Blot技术检测1型糖尿病小鼠缺血部位肌肉组织中CD31与HIF-1α的表达情况。
4.利用细胞流式术检测FGF21对1型糖尿病小鼠外周血中EPCs的动员情况。
5.利用ELISA试剂盒检测1型糖尿病小鼠血浆中VEGF与SDF-1的表达变化。
6.利用密度梯度离心法从人脐带血中分离出EPCs进行鉴定，并传代培养。
7.利用Western Blot技术检测蛋白激酶B（AKT）活化水平以考察EPCs对FGF21是否有响应。
8.利用体外含有33mM葡萄糖的饥饿培养基处理模拟高糖（HG）环境，通过细胞划痕实验，体外基质胶成管等实验等考察HG对EPCs的功能影响及FGF21的保护作用。
9.利用体外HG处理模拟糖尿病环境，检测HG环境下EPCs中NAD+含量变化以及体外补充FGF21对EPCs中NAD+含量的上调作用。
10.利用划痕实验、体外基质胶成管实验检测HG处理的EPCs补充NAD+对EPCs功能的影响。
11.利用siRNAs分别敲低Sirt1-Sirt7，确定NAD+改善HG处理EPCs功能的Sirt蛋白。
12.利用划痕实验、体外基质胶成管实验检测HG环境中分别加入AMPK,AKT等激酶的抑制剂后，FGF21对EPCs的保护作用，探索FGF21提高NAD+含量保护HG诱导EPCs功能损伤的分子机制。
结果:
1.成功构建1型糖尿病小鼠HLI模型，FGF21可提高1型糖尿病小鼠缺血部位血流恢复速度，增加新生血管数量。
2.FGF21增加1型糖尿病小鼠缺血部位肌肉中CD31与HIF-1α的表达。
3.FGF21对1型糖尿病HLI模型小鼠血浆中EPCs有动员作用。
4.FGF21能够提高1型糖尿病HLI模型小鼠血浆中VEGF与SDF-1表达量。
5.从人脐带血中成功分离EPCs并鉴定，以备后续实验。
6.EPCs表达FGF21的受体FGFR1，且EPCs对FGF21刺激有响应。
7.HG环境损伤EPCs的迁移、成管能力，给予FGF21对EPCs具有保护作用。
8.HG环境下EPCs中NAD+表达下降，给予FGF21可提高EPCs中NAD+含量。
9.体外补充NAD+能够改善HG诱导的EPCs功能损伤。
10.阻断Sirt1能够抑制NAD+对高糖处理EPCs功能的改善作用。
11.抑制EPCs中AMPK的活性能够阻断HG环境中FGF21对EPCs的保护作用，由此推断FGF21保护HG环境中EPCs功能可能通过AMPK介导。
结论：
FGF21能有效促进1型糖尿病HLI小鼠缺血后肢血流恢复和血管新生。HG损伤EPCs的迁移、管样结构形成能力，而FGF21可以有效改善HG环境下EPCs的迁移和管样结构形成能力。HG处理的EPCs中NAD+含量下降，FGF21处理能够提高EPCs中NAD+的含量，进而增强Sirt1活性，改善HG环境中EPCs的功能。而抑制AMPK的活性阻断FGF21对EPCs的保护作用。上述研究结果表明，FGF21可能主要通过保护糖尿病EPCs功能促进糖尿病HLI后的血流恢复和血管再生，FGF21可能通过AMPK介导的NAD+上调发挥保护作用。
糖尿病缺血性疾病是糖尿病并发症之一，严重威胁人类健康与患者的生存质量。促进血管新生是治疗糖尿病缺血性疾病的有效策略。内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是内皮细胞的前体细胞，在血管生成中发挥重要作用。给裸鼠移植经体外扩增的外周血、脐带血或骨髓来源的EPCs能有效促进缺血后肢、缺血心脏的血管再生。但糖尿病患者外周循环中EPCs数量减少、功能受损，是糖尿病患者血管生成障碍、缺血性疾病发病的重要诱因。成纤维细胞生长因子21（Fibroblast Growth Factor21，FGF21）是FGF家族成员，在调节糖脂代谢中起关键作用，有治疗糖尿病及糖尿病心肌病并发症的潜力，但其对糖尿病缺血性疾病是否具有改善作用尚有待研究。
本课题利用1型糖尿病小鼠后肢缺血（Hind Limb Ischemia，HLI）模型考察FGF21是否具有治疗糖尿病缺血性疾病的潜能，在此基础上，利用体外高糖（HG）处理模拟糖尿病环境，探索FGF21是否能够保护EPCs功能。探索FGF21治疗糖尿病HLI可能的分子机制，进而为治疗糖尿病缺血性血管疾病提供新的思路。
方法：
1.采用STZ五次小剂量（50mg/kg.d）注射构建1型糖尿病小鼠，利用1型糖尿病小鼠构建糖尿病HLI模型并给予FGF21治疗，通过激光多普勒血流灌注成像分析仪（Laser Doppler Perfusion Image，LDPI）检测1型糖尿病小鼠缺血后肢血流灌注量的恢复情况进而考察FGF21的治疗作用。
2.利用免疫荧光技术检测1型糖尿病小鼠缺血部位新生血管密度。
3.利用Western Blot技术检测1型糖尿病小鼠缺血部位肌肉组织中CD31与HIF-1α的表达情况。
4.利用细胞流式术检测FGF21对1型糖尿病小鼠外周血中EPCs的动员情况。
5.利用ELISA试剂盒检测1型糖尿病小鼠血浆中VEGF与SDF-1的表达变化。
6.利用密度梯度离心法从人脐带血中分离出EPCs进行鉴定，并传代培养。
7.利用Western Blot技术检测蛋白激酶B（AKT）活化水平以考察EPCs对FGF21是否有响应。
8.利用体外含有33mM葡萄糖的饥饿培养基处理模拟高糖（HG）环境，通过细胞划痕实验，体外基质胶成管等实验等考察HG对EPCs的功能影响及FGF21的保护作用。
9.利用体外HG处理模拟糖尿病环境，检测HG环境下EPCs中NAD+含量变化以及体外补充FGF21对EPCs中NAD+含量的上调作用。
10.利用划痕实验、体外基质胶成管实验检测HG处理的EPCs补充NAD+对EPCs功能的影响。
11.利用siRNAs分别敲低Sirt1-Sirt7，确定NAD+改善HG处理EPCs功能的Sirt蛋白。
12.利用划痕实验、体外基质胶成管实验检测HG环境中分别加入AMPK,AKT等激酶的抑制剂后，FGF21对EPCs的保护作用，探索FGF21提高NAD+含量保护HG诱导EPCs功能损伤的分子机制。
结果:
1.成功构建1型糖尿病小鼠HLI模型，FGF21可提高1型糖尿病小鼠缺血部位血流恢复速度，增加新生血管数量。
2.FGF21增加1型糖尿病小鼠缺血部位肌肉中CD31与HIF-1α的表达。
3.FGF21对1型糖尿病HLI模型小鼠血浆中EPCs有动员作用。
4.FGF21能够提高1型糖尿病HLI模型小鼠血浆中VEGF与SDF-1表达量。
5.从人脐带血中成功分离EPCs并鉴定，以备后续实验。
6.EPCs表达FGF21的受体FGFR1，且EPCs对FGF21刺激有响应。
7.HG环境损伤EPCs的迁移、成管能力，给予FGF21对EPCs具有保护作用。
8.HG环境下EPCs中NAD+表达下降，给予FGF21可提高EPCs中NAD+含量。
9.体外补充NAD+能够改善HG诱导的EPCs功能损伤。
10.阻断Sirt1能够抑制NAD+对高糖处理EPCs功能的改善作用。
11.抑制EPCs中AMPK的活性能够阻断HG环境中FGF21对EPCs的保护作用，由此推断FGF21保护HG环境中EPCs功能可能通过AMPK介导。
结论：
FGF21能有效促进1型糖尿病HLI小鼠缺血后肢血流恢复和血管新生。HG损伤EPCs的迁移、管样结构形成能力，而FGF21可以有效改善HG环境下EPCs的迁移和管样结构形成能力。HG处理的EPCs中NAD+含量下降，FGF21处理能够提高EPCs中NAD+的含量，进而增强Sirt1活性，改善HG环境中EPCs的功能。而抑制AMPK的活性阻断FGF21对EPCs的保护作用。上述研究结果表明，FGF21可能主要通过保护糖尿病EPCs功能促进糖尿病HLI后的血流恢复和血管再生，FGF21可能通过AMPK介导的NAD+上调发挥保护作用。