生物乙醇可以用可再生的生物质发酵生产,它易于和汽油混合,易于长距离运输和储存,易于大规模低成本工业生产,因而被认为是最有潜力的清洁可再生能源。木质纤维素原料多为农林废弃物,利用其为原料,替代目前以淀粉或糖为原料的生物乙醇生产方式,可以降低能源与粮食的原料竞争,是目前以及未来的发展趋势。酿酒酵母是传统乙醇生产菌株,其具有高效利用己糖,高乙醇耐受力,较好的抗逆性等优良特性。发酵木质纤维素原料产乙醇酿酒酵母面临两个重要问题。首先,木质纤维素原料需要水解为酿酒酵母可发酵的糖,水解过程的预处理环节不可避免的产生对酿酒酵母生长发酵有影响的毒性抑制物,因此用于木质纤维素乙醇发酵的菌株需要对这些抑制物有较强的抗性。其次,木质纤维素水解液中有～30%的木糖组分,其充分利用是实现经济上可行性的木质纤维素乙醇生产关键因素之一。现有木糖利用酿酒酵母构建工作通常是在酿酒酵母中引入木糖还原酶-木糖醇脱氢酶,或者木糖异构酶使木糖转化为木酮糖。产生的木酮糖经磷酸化后进入磷酸戊糖途径,再通过系列转酮转醛反应,以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛的形式回到糖酵解途径,最终产生乙醇。但在某些细菌和古菌中存在一条更为简单的木糖氧化代谢途径。木糖首先被木糖脱氢酶催化生产木糖酸内酯,木糖酸内酯可以自发的或被木糖酸内酯水解酶催化生成木糖酸,继而在木糖酸脱水酶催化下产生2-酮-3-脱氧-木糖酸。2-酮-3-脱氧木糖酸被2-酮-3-脱氧木糖酸裂解后生成乙醇醛和丙酮酸,丙酮酸可直接进入三羧酸循环或发酵产乙醇,乙醇醛则磷酸化后最终进入糖酵解途径。目前,包括本课题组在内的两个课题组已经成功在酿酒酵母中表达了木糖酸脱氢酶。本文的工作主要包括两个方面:(一)研究酿酒酵母抗氧化能力和香草醛抗性的关系酚醛类抑制物存在于所有木质纤维素水解液中,是植物木质素组分分解产物,主要抑制细胞生长和乙醇生成速率。香草醛是水解液中一种简单的含愈创木基的酚醛,有研究表明,香草醛会因引起细胞氧化胁迫,在较低的浓度下即可对酿酒酵母成长产生强烈抑制,因而常作为一种代表性抑制物被研究。另一方面香草醛广泛使用于食品、医药等领域的化学品,是一种有较高经济价值的产品,若要在酿酒酵母中重头合成香草醛也需要提高酿酒酵母对香草醛的耐受性。在实验室前期工作中,通过EMS诱变和木质纤维素原料中的适应性进化,成功筛选出一株高耐受香草醛的酿酒酵母工业菌株EMV-8。在本工作中,我们首先利用RNA测序技术,在转录学层面分析菌株EMV-8及其亲本菌株NAN-27的差异。从分子功能和代谢途径的角度的全面分析的结果显示,与NAN-27相比,EMV-8中有关能量产生代谢途径、氧化还原相关酶类、以及抗氧化相关的基因转录水平明显高于NAN-27。进而,我们从提高酿酒酵母代谢细胞内ROS的基因的表达水平和提高细胞内还原型谷胱甘肽含量及加强其代谢ROS的能力两个方面研究酿酒酵母抗氧化系统和香草醛抗性的关系。提高细胞质过氧化氢酶(Ctt1p)表达水平的酿酒酵母菌株在含有香草醛的培养基中葡萄糖的消耗速率、香草醛的转化速率、乙醇的生产速率均高于对照菌株。提高谷胱甘肽过氧化氢酶(Gpx1p)表达水平可以减少酿酒酵母在香草醛胁迫下的ROS浓度,提高酿酒酵母菌株在含有香草醛的培养基中的最大生长速率。提高过氧化物酶体过氧化氢酶(Cta1p)、谷胱甘肽还原酶表达水平(Glr1p)表达水平没有明显影响酿酒酵母菌株的葡萄糖消耗速率、香草醛转化速率、乙醇生产速率。同时超表达过氧化氢酶、超氧化物歧化酶则会明显降低酿酒酵母菌株在含有香草醛的培养基中葡萄糖的消耗速率、香草醛的消耗速率、乙醇生产速率。(二)在酿酒酵母中表达木糖酸脱水酶目前公布的木糖酸脱水酶基因十分有限,我们通过人工合成Pseudomona、Burkholderiasp、Achromobacter xyosoxidans三种来源的木糖酸脱水酶基因,将其引入酿酒酵母。但遗憾的是,酶活测定结果表明,这三种木糖酸脱水酶基因均不能在酿酒酵母中活性表达。该途径的建立仍需大量后继工作。