双氢睾酮对大鼠卵泡颗粒细胞和小鼠卵巢抗苗勒管激素表达以及原始卵泡发育的影响

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目的探究双氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)对原代培养的大鼠卵泡颗粒细胞(granulosa cells,GCs)抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)表达以及小鼠卵巢原始卵泡体外发育、AMH表达的影响。方法1.第一部分实验:从21d SD雌性大鼠卵巢中提取卵泡GCs原代培养48h,先用HE染色检测GCs形态、卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)细胞免疫荧光检测GCs纯度;然后根据分组即对照组(无试剂干预)、10-5 mol/L DHT组、10-8 mol/L DHT组、2×10-5 mol/L蛋白激酶B(AKT)抑制剂(MK-2206 2Hcl)组和10-8 mol/L DHT+2×10-5 mol/L MK-2206 2Hcl组,分别使用相应浓度的试剂再干预GCs3h;干预完成后,细胞免疫荧光染色观察AMH表达的部位和变化。Western blot测定各组AMH、p-AKT蛋白表达量。2.第二部分实验:3d的ICR小鼠卵巢取出后根据分组即对照组(无试剂干预)、10-8 mol/L DHT组、2×10-5 mol/L MK-2206 2Hcl组和10-8 mol/L DHT+2×10-5 mol/L MK-2206 2Hcl组,分别使用相应浓度的试剂干预4d;HE染色后计数各组原始卵泡、早期生长卵泡在整个卵巢中的个数;免疫组化检测各组小鼠卵巢PCNA、AMH的表达;Western blot检测各组小鼠卵巢AKT信号通路相关因子(AKT、FoxO3a、PTEN)、AMH以及PCNA蛋白表达的变化。HE染色、免疫组化以及Western blot比较3d组和7d组小鼠卵巢原始卵泡、早期生长卵泡在整个卵巢中的个数、PCNA以及AMH等指标的变化。结果1.第一部分实验:AMH主要表达在大鼠卵泡GCs的细胞膜和细胞质中;与对照组比较,10-8 mol/L DHT和10-5 mol/L DHT均使GCs AMH表达增加(P<0.05),两种浓度DHT对GCs AMH表达的影响无统计学差异(P>0.05);与对照组比较,10-8 mol/L DHT使GCs的p-AKT、AMH表达升高(P<0.05),2×10-5 mol/L MK-2206 2Hcl使GCs的AMH表达降低(P<0.05);与MK-2206 2Hcl处理组比较,DHT+MK-2206 2Hcl处理组AMH表达升高(P<0.05)。2.第二部分实验:AMH主要表达在小鼠卵巢早期生长卵泡的颗粒细胞上,在原始卵泡上表达较少;经过DHT处理,小鼠卵巢生长卵泡数量、生长卵泡占总卵泡数的比例、PCNA、AMH、p-AKT、p-FoxO3a的表达升高(P<0.05),PTEN的差异无统计学意义(P>0.05);经过MK-2206 2Hcl的处理,小鼠卵巢早期生长卵泡数量、早期生长卵泡占总卵泡数的比例、PCNA、AMH、p-AKT表达降低(P<0.05);与MK-2206 2Hcl处理组比较,DHT+MK-2206 2Hcl处理组小鼠卵巢早期生长卵泡数量、早期生长卵泡占总卵泡数的比例、PCNA、AMH表达升高(P<0.05);7d组小鼠卵巢早期生长卵泡数量、早期生长卵泡占总卵泡数的比例、PCNA以及AMH表达量均高于3d组(P<0.05)。结论DHT不仅可以上调大鼠卵泡GCs和小鼠卵巢AMH的表达,还可以启动小鼠原始卵泡发育,且这些作用可能与激活AKT信号通路有关。
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