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自从1983年Barish在爪蟾卵母细胞中发现钙离子激活的氯离子通道(calcium-activated chloride channels,CaCCs)以来,这种类型的Cl-通道备受关注,对其在不同组织中的重要作用的报道相继而来。CaCCs组织分布广泛,参与众多生理过程,如感觉传导、神经和心肌兴奋性调节、腺体和上皮分泌等,甚至参与细胞分裂周期和细胞增殖。但是,CaCCs的分子基础一直未被阐明。直到2008年,由三个实验室分别独立发现构成CaCCs的分子基础是跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A,TMEM16A)。TMEM16A 属于 Anoctamin 家族,有8个跨膜结构域,氨基和羧基末端都在胞内。电生理研究表明,TMEM16A可被胞内Ca2+直接激活而产生Ca2+激活的氯电流(calcium-activated chloride current,ICl,Ca)。已知,心肌同样存在CaCCs,在维持心肌兴奋性中发挥着重要的作用。但是,心肌CaCCs的分子基础是何目前尚未澄清。本研究以C57BL/6J小鼠和原代心肌细胞为对象,利用细胞和分子生物学研究技术鉴定小鼠心肌细胞是否存在TMEM16A,分析其在小鼠心脏的分布和表达模式,及其随小鼠心脏发育而呈现的动态变化;并进一步利用电生理技术记录心肌CaCCs通道的电流,分析其生物物理特性和与TMEM16A的关系,为理解心肌CaCCs的分子基础提供实验数据。主要实验结果如下:利用成年小鼠的心脏组织,PCR检测结果显示,成年期小鼠心脏中以TMEM1 6A基因的表达为主,TMEM16B基因的表达很少;蛋白水平上,TMEM16A以75kD大小的蛋白表达为主。收集小鼠不同胚胎期(E8.5～E18.5)心脏,RT-qPCR技术检测其TMEM16A的变化趋势。结果表明,在mRNA水平上,TMEM16A胚胎期的表达总体高于成年期。在心脏开始发育的E8.5天,即可检测到TMEM16A的存在,在E10.5天其表达瞬时升高达峰值,之后逐渐下降,到E18.5天时基本与成年期相同。在蛋白表达水平上,TMEM16A的表达与mRNA水平不一致,并没有出现瞬时的增高,而是随胚胎期心脏的发育而逐渐增高。利用细胞免疫荧光和激光共聚焦技术,在急性分离的成年小鼠心肌细胞、新生小鼠和胚胎期小鼠的心肌细胞观察TMEM16A的亚细胞分布。结果表明,无论是在哪一时期的心肌细胞中,TMEM16A均分布于细胞质中和细胞膜上。取1～3天龄新生小鼠心脏,酶解消化分离心肌细胞,置CO2培养箱培养1天后,利用全细胞膜片钳技术记录心肌细胞中ICl,Ca。将膜电位钳制在-55mV,给予细胞+80mV、持续50ms的pre-pulse,紧接着给予细胞为时300ms、从-40mV到+60mV,阶跃10mV的刺激。结果显示,可记录到随着去极化程度增高而幅度增大的外向电流;改变细胞外液中氯离子浓度,所记录电流的反转电位与氯离子平衡电位相近;而且,在氯离子通道抑制剂Niflumic acid(NFA)存在条件下,该电流浓度依赖地减小,并且NFA对该电流的半抑制浓度(IC50)为16.94204μM;同时,该电流能被caffeine所抑制,提示所记录的电流是ICl,Ca。之后利用TMEM16A的特异性抑制剂T16Ainh-AO1作用于该电流,发现T16Ainh-AO1能抑制电流,并且IC50为2.1497μM,说明该ICl,Ca是TMEM16A产生的电流。实验发现,TMEM16A KO小鼠的心重和体重均低于对照组,但是其心重/体重高于对照组。而且,在mRNA水平上,检测Serca2a、NCX、ANF、BNF和β-MHC的水平。发现,作为心肌肥大的标志:ANF和BNF有增高的趋势,但是β-MHC不确定。但是,在典型的心肌肥大中,NCX水平是上调的,Serca2a水平是下调的,在这一点上,TMEM16A knockout(KO)小鼠也有这样的趋势。综上所述,TMEM16A和TMEM16B虽均为CaCCs,但在小鼠心肌中以TMEM16A的表达为主,它分布在心肌细胞的细胞质和细胞膜上;在胚胎发育过程中,TMEM16A的表达呈现出动态的变化。实验记录到原代心肌细胞中ICl,Ca,初步判断TMEM16A是心肌CaCCs的分子基础。TMEM16A KO小鼠的心脏组织具有心肌肥大的特征。这对于进一步研究TMEM16A在心脏中的作用提供了一定的实验依据。