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绿僵菌素(destruxin)是金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae产生的一种环缩肽类化合物,绿僵菌素A(DA)是最常见的一种绿僵菌素同系物,具有杀虫活性,能抑制昆虫先天性免疫作用,但其分子水平的作用机制仍不清楚。本课题组在前期研究中,利用DA处理家蚕Bombyx mori Bm12细胞后,提取总蛋白质,再用蛋白酶降解,再通过电泳分离了特异性条带,经质谱鉴定该条带中包5种热休克蛋白(heat shock proteins,HSP)(BmHSP70,BmHSP75,BmHSP90,BmHSCP,BmHSP97),疑似它们与DA存在互作关系。因此,本研究拟构建这5种家蚕热休克蛋白的原核表达系统,通过镍亲和层析分离纯化目标蛋白,然后采用生物膜干涉(Bio-Layer Interferometry,BLI)技术分析这些热休克蛋白与DA的亲和力,最后通过荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术对DA处理家蚕Bm12细胞后上述热休克蛋白基因表达量进行定量分析,验证其是否为DA的结合蛋白。本文研究结果将为阐明DA作用的分子机理提供参考。主要研究结果如下:(1)家蚕热休克蛋白原核表达从家蚕Bm12细胞中提取总RNA,通过RT-PCR反转录和PCR扩增,分别克隆出Bm HSP75,Bm HSP90,Bm HSCP,Bm HSP97与Bm HSP70的全长编码序列,将扩增产物与pEASY-T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经过Kan-IPTG-Xgal平板筛选及PCR鉴定,初步获得了含HSP基因的阳性克隆。采用双酶切法将HSP片段连接到原核表达载体pET-30a上,并转化感受态细胞。利用卡那霉素抗性筛选出阳性菌落,通过鉴定引物T7/T7ter鉴定出阳性克隆,并进行DNA测序。结果表明,目的基因测序结果正确,筛选得到的阳性克隆菌液检测均连接成功,重组子测序结果与目的序列能够完全匹配,各重组子构建成功。(2)镍亲和层析纯化目标蛋白重组子原核表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导表达,收集菌体超声破碎,提取总蛋白,再经SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹分析显示,BmHSP75、BmHSP90和BmHSP70表达的目的蛋白约占总菌体蛋白的30%,目的蛋白分子量分别为74.9k Da、88.6kDa和71.7kDa。经镍离子亲和层析柱(N i-NTA)纯化和G250凝胶层析获得目标蛋白。Western-blot检测结果表明,BmHSP75、BmHSP90以及BmHSP70三种蛋白纯化成功。(3)生物膜干涉技术测定DA与热休克蛋白的亲和力委托南京德泰生物科技公司借助Forte Bio OctetQK系统,基于生物膜干涉技术(BLI)分析了BmHSP70,BmHSP75和BmHSP90三种蛋白与绿僵菌素A(DA)的分子之间相互作用,测定结果显示DA与上述热休克蛋白之间无亲和作用,没有互作关系。猜想前期研究结果中分离得到的热休克蛋白可能是DA处理家蚕细胞后,由于细胞的应激反应导致热休克蛋白高表达,酶解法中蛋白水解酶未能将大量表达的热休克蛋白完全水解,从而出现在特异性电泳条带之中。(4)DA对家蚕HSPs基因表达水平的影响用DA处理家蚕Bm12细胞后,以DA处理的细胞作为实验组,DA未处理的细胞的细胞作为对照,提取细胞总RNA,经RT-PCR反转录得的c DNA模板进行qPCR,结果发现DA处理组相对于对照组的Bm HSP75,Bm HSP90,Bm HSCP,Bm HSP97与Bm HSP70的基因均显著上调表达,DA以200mg/L处理Bm12细胞时,表达量比正常水平分别高4.53,6.91,10.38,11.59和12.01倍。本研究证明,DA作用下,刺激了家蚕Bm12细胞BmHSP75,BmHSP90,BmHSCP,BmHSP97与BmHSP70这5种热休克蛋白的大量产生,但DA与这些蛋白之间没有相互作用,不具备亲和性。