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产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)是一类能产生一种或一种以上志贺毒素大肠埃希菌的总称。STEC是重要的食源性致病菌,可引起人的感染性腹泻、出血性肠炎(hemorrhagic colitis,HC)及病死率高的溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)。志贺毒素(Shiga toxin,Stx)是STEC最关键的致病因子,但其他一些致病因子如紧密粘附素(Intimin)、肠溶血素(Enterohemolysin,EhxA)等在STEC致病性中也发挥一定的作用。O157:H7是STEC中最常见、最重要的血清型,但近年来由非0157 STEC引起的散发感染或暴发逐渐增多,在许多国家或地区甚至超过STEC 0157。本研究拟了解中国腹泻患者和健康人群粪便中非0157 STEC检出情况,并从血清分型、毒力基因特征、多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)、志贺毒素噬菌体分析及全基因组测序分析等方面对分离菌株进行分析。2010年-2014年间,从河南睢县、四川自贡、青海玉树、深圳龙岗和上海5个地区的腹泻患者或健康人粪便标本中共分离非0157 STEC菌株27株,部分地区腹泻患者非0157 STEC的分离率约为1.3%,而健康人群的分离率仅约0.2%。27菌株分为16种不同的O:H血清型,最常见为O130:H8血清型,包括6株菌;026:H11和0117:H8血清型分别包括3株菌;091:H14和O107:H7血清型分别包括2株菌;其余11种血清型(O111:H8、0112:H8、021:H25、084:H2、05:HNT、020:H30、ONT:H30、O104:H7、048:H21、O149:H10 及 043:H2)分别只有 1 株菌。MLST将27株非0157 STEC菌株分为16种序列型(Sequence type,ST),最主要的ST型别为ST13,包括9株菌;ST21和ST504型分别包括3株菌和2株菌;其余13株菌分别属于不同的ST型。志贺毒素分型结果显示,11株携带stx1a亚型;12株为stx1c亚型菌株;而携带stx2d亚型菌株1株,stx2e亚型菌株3株;1株菌同时携带stx1a和stx2b两种志贺毒素亚型。其他毒力基因 eae、efa1、saa、paa、astA及ehx 的携带率分别为 18.5%(5)、18.5%(5)、29.6%(8)、22.2%(6)、11.1%(3)、11.1%(3)及 25.9(7)%。对两株stx2&阳性菌株STEC413和STEC509的Stx2诱导及Vero细胞毒性测定表明,这两株菌在丝裂霉素C诱导剂的作用下Stx2e的诱导性及对Vero细胞的毒性均明显低于STEC 0157:H7暴发菌株Xuzhou21。通过全基因组测序所获得的STEC413和STEC509菌株Stx2e前噬菌体序列,其大小分别为32133bp和61142bp;C+G%分别为48%和49%;染色体插入位点分别为opmW和yecE;所包含CDS数量分别为58和105。与猪来源菌株S1191的Stx2e噬菌体参考序列相比,STEC413携带的Stx2e噬菌体序列与其相似性仅为50.0%,二者拥有相似的整合酶,但插入位点和调控基因Q均不同。而STEC509携带的Stx2e噬菌体序列非常特异,尚无类似的噬菌体序列报道,表明Stx2e噬菌体基因组具有高度多样性。通过与不同致病型和共生型大肠埃希菌及志贺菌属的全基因进化分析,发现STEC413菌株与共生型大肠埃希菌有较近的亲缘关系,而STEC509菌株与其他非0157 STEC菌株有较近的亲缘关系,表明Stx2e噬菌体可以整合到不同遗传背景的大肠埃希菌菌株中。除噬菌体编码的志贺毒素、LEE岛编码紧密粘附素(intimin)外,位于大质粒p0157上的肠溶血素作为STEC 0157:H7的毒力因子在致病性中也发挥重要作用。本研究对非0157 STEC菌株的肠溶血素基因(ehxA)进行了分析。434株非0157 STEC中检测出138株(31.8%)ehxA基因阳性菌株,分别来自健康人(1株)、腹泻患者(9株)、不同动物(108株)及食品(20株)。通过PCR扩增测序得到了 138条ehxA基因全长序列,根据序列相似性分为36种不同的序列型。将本研究中获得的36条特异序列,结合GenBank中代表性ehxA序列,进行Neibour-Joining(N-J)进化分析。根据N-J树和序列相似性,将ehxA划分为3个组别,即Group(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)。通过对不同组别非0157STEC菌株溶血特性、血清型、来源、毒力基因特征等的分析发现,腹泻患者的菌株均属于Group Ⅱ,且多数携带毒力基因eae,而动物(97.1%)和食品(80%)来源的菌株多分布在Group Ⅰ中。总之,通过本研究,初步了解了中国部分地区人源非0157 STEC的流行情况和菌株基本特征;丰富了人源性stx2eSTEC菌株及Stx2e噬菌体基因组的认识;建立了基于序列分析的肠溶血素基因(ehxA)分型的方法,该方法对菌株的致病潜力具有一定的预测作用。