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目前体内、外研究表明,TGF-β1/Smad信号通路在肾小球硬化发生发展中起重要作用。FGF-β1促纤维化的作用大部分都是通过Smad3介导的,Smad3丢失后能阻止TGF-β1诱导的EMT和胶原、PAI-1、TIMP-1基因的表达,Smad3敲除的小鼠对各种实验性器官纤维化模型(如放射线诱发的皮肤纤维化,博莱霉素诱导的肺纤维化,四氯化碳诱导的肝纤维化和链唑霉素诱导的I型糖尿病的肾小球硬化)都有抵抗效果;在EMT导致的纤维化改变中(如增殖性玻璃体视网膜病变,角膜损伤,单侧输尿管阻塞的动物模型),Smad3缺失的小鼠的纤维化反应随之消失。若采用各种方法上调Smad7的表达,或者使用小分子物质halofuginone抑制Smad3,均能显著减轻各种器官纤维化动物模型的纤维化程度。近年来还报道IFN-γ具有抗纤维化功能,在肝、肾纤维化动物模型中,均证明IFN-γ具有显著抑制ECM合成的作用。实验表明,IFN-γ下游的Jak/Stat和CKⅡ/YB-1信号通路均参与这种作用,还证明与TGF-β1/Smad信号通路存在串话(cross-talk)。本课题拟采用细胞转基因及RNA干扰技术,观察增强或降低Smad3的表达对体外培养的大鼠肾MsC ECM组分、基质金属降解酶及其抑制剂系统表达的影响;探讨Smad3在γ-IFN信号转导系统影响TGF-β1的信号转导过程中的作用,为进一步阐明TGF-β1/Smad信号通路在肾小球硬化发生中的作用,及γ-干扰素对肾小球疾病的防治提供理论和实验依据。第一部分Smad3基因稳定转染对大鼠肾系膜细胞ECM代谢的影响目的通过细胞转基因技术,获得稳定过表达Smad3的MsC克隆;观察Smad3过表达对MsC ColⅣ、FN和MMP-2/TIMP-2表达的影响;观察Smad3对FN启动子活性的影响。方法构建plRES2-EGFP-Smad3真核表达质粒;采用脂质体介导法,G418筛选,将Smad3基因稳定转染体外培养的MsC,并作鉴定;分别用实时荧光定量RT-PCR、Western blot法,观察在TGFβ1作用下,转基因MsC ColⅣ、FN和MMP-2/TIMP-2基因转录及蛋白表达的改变。将含FN启动子的pGL2F1900质粒转染MsC,通过测定荧光素酶活性以显示启动子的活性。结果成功构建pIRES2-EGFP-Smad3真核表达质粒,获得稳定过表达Smad3的MsC克隆;TGFβ1可显著促进其ECM合成,表现为ColⅣ、FN mRNA分别升高2.5倍和1.3倍(P＜0.05),蛋白水平分别升高3.1倍和1.5倍(P＜0.05);TGFβ1可明显上调MMP-2、TIMP-2的表达,基因转录分别升高1.8倍和2.5倍(P＜0.05),蛋白表达分别升高2.1倍和3倍(P＜0.05)。Smad3稳定表达的MsC细胞,Flue相对活性是空白细胞株的2.3倍:RNA干扰抑制Smad3后,Fluc相对活性与空白细胞对照则无差异。小结构建pIRES2-EGFP-Smad3真核表达质粒,建立稳定过表达Smad3的MsC克隆;Smad3基因稳定过表达后,TGF-β1促进MsC ECM成分合成的作用明显增强,表现为ColⅣ、FN蛋白水平明显升高;同时,TGF-β1上调MsCMMP-2、TIMP-2表达均明显增强。Smad3过表达能提高FN启动子的活性。第二部分RNA干扰Smad3基因表达对大鼠肾MsC ECM代谢的影响目的构建Smad3干扰质粒;探讨Smad3经RNA干扰后对大鼠肾MsCColⅣ、FN和MMP-2/TIMP-2表达的影响。方法构建Smad3干扰质粒;将质粒瞬时转染体外培养的MsC,采用实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测Smad3干扰的效果,筛选有效干扰质粒;采用实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测Smad3干扰后ColⅣ、FN和MMP-2/TIMP-2基因转录及蛋白表达的影响。结果经RNA干扰质粒瞬时转染的MsC,其Smad3 mRNA及蛋白表达均明显下降;Smad3干扰后TGF-β1作用下MsC ColⅣ、FN和MMP-2/TIMP-2基因转录及蛋白表达均明显下降(mRNA水平分别下降44%、54%、47%、53%,蛋白水平分别下降32%、45%、52%、47%)(P＜0.05)。小结获得有效减低Smad3表达的干扰质粒;Smad3干扰能降低ColⅣ、FN和MMP-2/TIMP-2基因转录及蛋白表达。第三部分γ-干扰素对大鼠肾系膜细胞TGFβ/Smad信号通路和ECM代谢的影响目的用IFN-γ处理培养的MsC,观察其增殖、TGF-β1/Smad信号通路和MMP-2/TIMP-2基因的转录及蛋白表达的变化,探讨IFN-γ减轻肾小球硬化的可能作用机制。方法用不同浓度的IFN-γ刺激MsC,MTT法检测对细胞增殖的影响;100IU/mL IFN-γ作用于MsC后,在不同时间(0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h)收集细胞,分别应用实时荧光定量RT-PCR、Western blot检测其TGF-β1/Smad信号通路(Smad3、Smad7)、MMP-2/TIMP-2转录及蛋白表达的变化。结果经IFN-γ处理的MsC,其增殖不受影响;Smad7的基因转录及蛋白表达在IFN-γ作用0.5h后立即升高,仅维持在6h内,而Smad3的升高则在作用6h之后;MMP-2的基因转录及蛋白表达在作用6h时升高,而TIMP-2在6h时则降低。小结IFN-γ可能通过影响MsC的TGF-β1/Smad信号通路,增强MMP-2和降低TIMP-2的转录和表达而起到减轻肾组织纤维化的作用。结论1.成功建立过表达Smad3的阳性MsC克隆。Smad3过表达后,TGF-β1可显著促进ECM成分(ColⅣ、FN)合成,同时,TGF-β1可明显上调MMP-2、TIMP-2基因转录和蛋白分泌。2.获得能有效降低Smad3表达的siRNA载体。Smad3 siRNA质粒转染能降低MSC ColⅣ、FN、MMP-2、TIMP-2 mRNA及蛋白水平。3.Smad3可能通过提高FN启动子的活性而增强FN的表达。4.IFN-γ可能通过影响MsC的TGF-β1/Smad信号通路,增强MMP-2和降低TIMP-2的转录和表达而起到减轻肾组织纤维化的作用。因此,Smad与IFN-γ信号通路可能存在cross-talk。