小麦籽粒硬度是胚乳质地的反映,它是国际通用小麦分类指标之一,与磨粉品质、食品加工品质关系密切。硬度主要受pina和pinb基因控制,若其发生突变,籽粒一般表现为硬质。多酚氧化酶(PPO)是导致鲜湿面条、馒头、饺子发生褐变的主要因素。本文对这两性状及其分子机理进行了研究,主要结论如下: 1 普通小麦,特别是地方品种和农家品种pina和pinb等位变异较为丰富,共发现1个新的pina变异和3个新的pinb变异,均为单核苷酸突变,与硬度的变异关系较密切。西藏半野生小麦、密穗小麦、Spelt、粗山羊草未发现变异,野生二粒小麦及偃麦草则缺失此基因。 本文改进的Urea-SDS-PAGE凝胶电泳和普通TBE-PAGE凝胶相比,前者的分辨率显著高于后者,可检测单核苷酸突变。在DNA水平上检测pina和pinb的效率要高于蛋白质水平,不需设计不同的位点特异性引物,适于等位变异及单核苷酸多态性(SNP)的分析。 2 在小麦籽粒不同发育阶段,软硬质小麦胚乳中总Puroindolines(PinA和PinB)蛋白的表达差异不大,但淀粉颗粒结合的Puroindolines蛋白量差异非常明显,发育各阶段,软质小麦显著高于硬质小麦。基因同为野生型但硬度有差异的品种,其淀粉表面结合的Puroindolines蛋白量差异也明显,说明此结合特点是决定籽粒硬度的直接原因。 3 SDS可以显著提高PPO的提取效率,增加品种间差异,利于PPO活性的筛选。在某些品种间,PPO活性表现出不同的时间特性和温度特性。在普通小麦及其近缘种属中,籽粒PPO活性变异很大,但基本上偏向于中低活性分布。一些普通小麦品种PPO活性很低,在育种和研究上具有较高的应用价值。一般来说,六倍体小麦(AABBDD)活性高于粗山羊草(DD),而野生二粒小麦(AABB)活性很低。其中偃麦草的活性也较高。 4 利用中国春的缺体-四体材料,将两个PPO基因(PPO-1,PPO-2)分别定位在2A和2D上。它们均表现出一定的等位变异,尤其是PPO-2基因变异较为丰富。在PPO-1等位基因中,以a类型最多;而PPO-2等位基因中,以D型为主。这些等位基因中,其PPO活性分布较广泛,大都偏向于中低活性,活性过高或过低的品种较少。PPO-2等位基因中,A、B、E和F型的PPO活性较高;而H、I、D~*、K以及缺失类型的PPO活性则较低。 5 PPO-2基因两功能区之间存在一内含子,材料间有变异;PPO-2基因功能区序列同源性较高,但其变异将会对PPO活性产生一定的影响。小麦籽粒PPO同工酶随着籽粒的成熟而减弱(A、C区除外),低活性品种的减弱程度大于高活性品种。高活性品种其C区同工酶却逐渐增强,和籽粒PPO活性变化一致,而低活性品种正相反。在转录水平上,PPO-2基因表达在发育过程中逐渐增强,与PPO活性变化、C区同工酶的表达规律较一致,高活性品种表达水平一般高于低活性品种。表明,PPO-2基因与籽粒发育阶段PPO活性及C区同工酶表达有关。 6 收获并通过后熟的籽粒与发育后期籽粒相比,PPO活性显著降低、同工酶减弱,数目减少,PPO活性高低与其同工酶带的强弱一致。一些低PPO活性品种,甚至检测不到同工酶。籽粒萌动时,PPO活性升高,同工酶带增强,24小时后逐渐降低,同工酶带开始减弱。 7 抗坏血酸可有效地抑制小麦籽粒PPO活性,适量的抗坏血酸能显著抑制褐变,改善面片的色泽,在面食品加工中有着广阔的应用前景。