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目前,人工授精仍然是养猪业中应用最广泛的繁殖生物技术。精液质量是决定后代数量和人工授精成功率的最重要因素。公猪精液通常使用17℃液相储存,然而在保存期间精子细胞持续代谢,导致可用营养物质的耗尽和代谢终产物的积累。活性氧（ROS）是精子线粒体内氧代谢的副产物,是液相储存期间精子质量和有效存活时间的主要决定因素之一,但过量ROS诱导的氧化应激对一定比例的精子细胞造成损害,最终导致细胞功能受损和细胞死亡。因此,随着储存时间的延长,精液质量变差,受孕率下降。已知精浆具有抗氧化能力,精浆中的某些成分可以帮助精子抵御ROS引起的氧化应激。精浆中的外泌体（Exosome）含有大量脂质,蛋白质,micro RNA（miRNA）和信使核糖核酸（m RNA）,会对精子功能相关的关键过程产生积极影响。如今,Exosome已成为各领域的研究热点,miRNA和代谢组学可以有效预测靶标因子。因此为了探究精浆Exosome对猪精子在17℃液相储存期间的保护作用,本试验选择10头具有繁殖能力,平均22.4个月龄的长白公猪,通过计算机辅助精子分析系统（CASA）,评估精子质量,筛选出6份符合标准的样本,每份取等量（10 m L）的精液剂量汇集并均质化。具体研究结果如下:1、使用超速离心法分离公猪精浆Exosome。通过透射电镜（TEM）观察到明显的杯状结构,纳米颗粒追踪分析（NTA）显示平均直径为107 nm,蛋白质印记显示,存在CD81,CD63和CD9标记物,以上结果均符合Exosome的特征。2、将Dil染料标记的Exosome添加到精子稀释液中,通过免疫荧光法验证Exosome与精子细胞的融合。结果显示Exosome与精子细胞的融合随着时间和Exosome的浓度增加而增加。3、将不同浓度精浆Exosome（Exo-0,Exo-1,Exo-4,Exo-8,Exo-16）添加到稀释液中,17℃液相保存0,2,4,6 d检测精子的质量参数。结果显示,随着保存时间的延长,各组精子的DNA完整性,总抗氧化能力,抗氧化基因（SOD1,CAT,GPX1）,抗凋亡基因（Bcl2）的表达水平,活率及线粒体膜电位水平,MT-ND1,MT-ND6,PRDX3,PRDX5的表达水平逐渐下降;脂质氧化水平,促凋亡基因Bax和Caspase3的表达水平,线粒体活性氧（mt ROS）水平,ADP/ATP比率,MTCH1的表达水平逐渐上升;与Exo-0组相比,（Exo-1,Exo-4,Exo-8,Exo-16）组精子细胞的DNA完整性,总抗氧化能力,抗凋亡能力,线粒体功能均增加,其中,Exo-8和Exo-16组无显著差异（P＜0.05）;Exo-8组精子中AWN和AQN-1的表达及体外受精后的卵裂率显著高于Exo-0组（P＜0.05）。4、利用高通量测序技术比较无Exosome（Exo-0）和有Exosome（Exo-8）孵育下17℃液相保存第4 d的精子miRNA转录本的差异。在Exo-8组精子中有31个miRNA表达上调,21个miRNA表达下调,q RT-PCR证实了ssc–miR–6516下调,ssc–miR–128,ssc–miR–296–3p和ssc–let–7a上调的测序结果,荧光素酶报告基因实验验证了SETD7和MTCH1分别是ssc–miR–128和ssc–miR–296–3p的靶基因。5、通过非靶向代谢组学（LC-MS/MS）分析无Exosome（Exo-0）和有Exosome（Exo-8）孵育下17℃液相保存第4 d的精子细胞的代谢变化。Exo-0和Exo-8孵育的精子存在许多“脂质和类脂分子”相关的代谢物,KEGG通路显示主要与“代谢通路”有关,Exo-8孵育的精子中溶血磷脂类含量较Exo-0孵育的精子低,其中近一半为溶血磷脂酰胆碱（Lyso-PC）。综上所述,本研究成功提取到精浆Exosome,使用Exo-8和Exo-16浓度的Exosome可有效提高精液质量参数。通过miRNA表达谱与代谢组学分析猪精液17℃液相保存中精浆Exosome的功能,发现在17℃保存期间,公猪精浆Exosome可能通过ssc–miR–128下调SETD7,ssc–miR–296–3p下调MTCH1（PSAP）以及减少Lyso-PC的代谢来降低mt ROS的产生,减少精子细胞凋亡（apoptosis）,从而保护精子免受氧化应激,延长保存时间,提高卵裂率。本课题的完成为猪精浆Exosome在精子生理学中的功能研究提供了重要的理论依据,进一步增强了对猪精液17℃液相保存中氧化应激的认识,为延长精液保存时间、提高繁殖效率及养猪业的经济效益提供了重要支撑。