多层螺旋CT灌注成像在肝硬化中的实验和临床应用研究前言早期肝硬化由于形态学改变不明显，影像诊断一直是个难点，而血液动力学研究表明，此时肝脏动脉和门静脉系统的血流已经发生变化。本实验通过建立兔早期肝硬化模型，并进行多层螺旋CT肝脏灌注扫描，定量分析早期肝硬化的血液动力学变化，使我们可能在形态学变化之前发现早期肝硬化，为临床诊断早期肝硬化及判断疗效和愈后提供理论依据。本研究通过对兔早期肝硬化多层螺旋CT灌注成像的灌注参数与HIF-1α、VEGF表达的相关性进行研究，进而为临床基因靶点治疗肝脏疾病提供理论基础。另外通过探讨不同程度肝硬化患者的CT灌注参数与肝硬化程度的关系，寻找能反映肝硬化程度的灌注参数，以期建立不同程度肝硬化的定量诊断指标；同时通过研究肝硬化的血流动力学变化与肝脏容积变化及肝功能Child-Pugh分期的相关性，以更好的评价肝脏功能储备状况。实验材料与方法1．动物实验部分(1)实验动物模型制作新西兰大白兔80只，雌雄不限，体重2.0～3.1kg，随机分为2组，其中实验组50只，正常对照组30只。实验组给予皮下注射花生油稀释的50％四氯化碳，每周两次，第一周每次注射剂量为1.5ml／kg，第二周每次注射剂量为2ml／kg，第三周起每次注射剂量改为2.5ml／kg，共12周；对照组采用相同途径注射相同剂量的生理盐水。(2)CT扫描方法及检查技术实验组兔自给药前及给药后第2周起，每2周分别随即选取5只实验组兔和5只正常对照组兔进行多层螺旋CT肝脏灌注扫描。所用机型为GE公司的Light Speed16MSCT扫描仪。扫描方式为：电影扫描0.5s／每圈，管电压120KV，管电流60mA，层厚5mm，层间距5mm，矩阵512×512。增强扫描采用高压团注方式(优维显，300mgI／ml，注射速率2ml／s，剂量1ml／kg)，团注对比剂的同时启动快速动态扫描程序，持续时间50秒，采集图像200帧，再进行间隔扫描，描时间为25秒，间隔时间3秒，采集图像100帧，扫描条件同前，共采集图像300帧，扫描时间共计150秒。(3)灌注参数分析及灌注参数计算利用perfusion 3中的去卷积模型肝脏灌注软件进行数据处理。通过该软件处理可得到肝脏灌注参数，包括肝血流量(HBF)、平均通过时间(MTT)、肝动脉灌注指数(HAF)，并模拟计算出肝动脉灌注量(HAP)即HBF×HAF，门静脉灌注量(HPP)即HPP=HBF×(1-HAF)。分析给药前至12周末的血流灌注参数的变化。(4)血液生化指标的动态观察分别于兔实验模型制作前及制作后(随机选取5只)的每2周耳缘静脉取血，查血中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和白蛋白(ALB)，观测兔肝功能的变化。(5)标本制备CT灌注扫描后的兔立即处死，尽可能选取其与肝脏扫描层面相对应的肝实质，一部分置于10％福尔马林溶液固定行免疫组化检测；另一部分置于液氮内冻存留逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。(6)常规病理学检查与免疫组织化学检测常规病理学检查均采用HE染色；肝脏组织HIF-1α、VEGF免疫组织化学染色均采用通用型二步法。HIF-1α的判定标准参照Birner等方法；VEGF的判定标准参照Park等方法。(7)肝脏组织HIF-1αmRNA、VEGFmRNA的含量检测分别取约0.1g冰冻的肝脏组织复苏后，按Trizol试剂盒说明方法提取总RNA，并用紫外分光光度计测定总RNA浓度。以各组经紫外分光光度仪测定后调整RNA浓度为1μg／μl，作为模板配制RT-PCR反应液，采取二步法进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，β-actin作为内参照。以HIF-1α／β-actin、VEGF／β-actin的IOD(光密度值)比值表示HIF-1αmRNA、VEGFmRNA的相对表达水平。2．临床研究部分(1)健康志愿者22例，男15例，女7例，年龄25～70岁；经临床、生化及影像学检查确诊为肝硬化的患者25例，男17例，女8例，年龄35～75岁，并根据肝病严重程度的Child-Pugh分级方法将肝硬化病人进行分级：其中Child-PughA级11例；Child-Pugh B级10例；Child-Pugh C级4例。(2)对22例健康志愿者和25例肝硬化患者分别进行多层螺旋CT肝脏灌注扫描，扫描技术除高压团注方式(优维显，300mgI／ml，注射速率4.0～4.5ml／s，剂量1ml／kg)和团注对比剂5秒后启动快速动态扫描程序外，余均同动物实验部分。(3)灌注参数分析及灌注参数计算同动物实验部分。(4)肝容积测定全部病例行肝脏CT平扫，将扫描后获得的CT图像，分别在各自的CT机上逐层手工鼠标描绘测量各层面积，再乘以层厚，累加得到肝脏容积。3．统计学分析对所得结果采用SPSS 11.5统计学软件进行统计学分析。对于正态分布、方差齐性的计量资料，两组间比较采用t检验法或配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析的方法，而后采用SNK-q检验法进行均数间多重比较。数据以平均值±标准差形式表示。参数间相关分析采用Pearson法，对于等级数据相关性采用秩相关。以P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果1．兔肝功能的变化情况兔血清AST、ALT的数值在注药前后有明显变化，在注药后AST、ALT的数值明显升高，在4周末达到高峰，后缓慢下降，其中ALT值较AST变化更明显，峰值达191U／L；ALB变化不明显，在10、12周末稍有降低。2．CT灌注扫描结果正常对照组兔各组CT灌注参数比较无统计学意义(P＞0.05)，实验组兔自2周末至12周末，肝动脉灌注量(HAP)呈逐渐升高趋势，正常对照组兔和实验组兔第2周末比较无统计学意义(P＞0.05)，但与第4、6、8、10及12周末实验组兔比较均有统计学意义(P＜0.05)；对照组兔门静脉灌注量(HPP)在不同时期比较差异无统计学意义(P＞0.05)，对照组兔和实验组兔在第2周末比较HPP差异无统计学意义(P＞0.05)，与第4、6、8、10、12周末实验组兔比较HPP差异有统计学意义(P＜0.05)；正常对照组兔肝血流量(HBF)在不同时期比较差异无统计学意义(P＞0.05)，对照组兔和实验组兔在第2、4、6周末比较HBF差异无统计学意义(P＞0.05)，但与第8、10、12周末实验组兔比较HBF差异有统计学意义(P＜0.05)；正常对照组兔平均通过时间(MTT)在不同时期比较差异无统计学意义(P＞0.05)，对照组兔和实验组兔在第2、4周末比较MTT差异无统计学意义(P＞0.05)，但与第6、8、10和12周末实验组兔比较MTT差异有统计学意义(P＜0.05)。3．病理结果根据常规病理检查(HE染色)得到的病理结果，将实验组兔肝脏的病变过程分为肝炎期、肝纤维化期和早期肝硬化期，其中2周末、4周末为肝炎期；6周末、8周末为肝纤维化期；10周末、12周末为早期肝硬化期。4．HIF-1α在肝组织的表达情况HIF-1α免疫组织化学染色阳性表达主要位于肝细胞的细胞浆中，部分细胞核中也有表达，阳性表达呈棕黄色颗粒。HIF-1α在早期肝硬化期(10周末、12周末)阳性表达数为10例；在肝纤维化期(6周末、8周末)阳性表达数为9例；在肝炎期(2周末、4周末)阳性表达数为4例。5．VEGF在肝组织的表达情况VEGF免疫组织化学染色阳性表达位于肝细胞的细胞浆、细胞核和血管内皮细胞中，阳性表达呈棕黄色颗粒。VEGF在早期肝硬化中(10周末、12周末)阳性表达数为10例；在肝纤维化期(6周末、8周末)阳性表达数为9例；在肝炎期(2周末、4周末)阳性表达数为4例。6．HIF-1αmRNA的检测结果HIF-1αmRNA的表达水平从第2周末至第12周末是依次增加的。7．VEGFmRNA的检测结果VEGFmRNA的表达水平从第2周末至第12周末是依次增加的。8．CT灌注扫描参数与HIF-1α、VEGF表达的相关性HAP、MTT和HIF-1α、VEGF的表达呈正相关r=0.532，P＜0.05；r=0.381，P＜0.05)；HPP、HBF和HIF-1α、VEGF的表达呈负相关(r=-0.721，P＜0.05；r=-0.687，P＜0.05)。9．不同程度肝硬化患者CT灌注扫描参数的变化Child-PughA级、Child-PughB级和Child-PughC级患者HAP与正常组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，但Child-PughA级和Child-PughB级患者相比，HAP增加不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)，Child-PughB级与Child-PughC级患者相比HAP差异有统计学意义(P＜0.05)；Child-PughA级、Child-PughB级和Child-PughC级患者与正常组比较HPP差异均有统计学意义(P＜0.05)，Child-PughB级、Child-PughC级患者与Child-PughA级相比HPP差异有统计学意义(P＜0.05)，Child-PughB级和Child-PughC级患者相比HPP差异有统计学意义(P＜0.05)；Child-PughA级、Child-PughB级和Child-PughC级患者与正常组比较HBF差异均有统计学意义(P＜0.05)，Child-PughB级与Child-PughA级患者相比HBF差异有统计学意义(P＜0.05)，Child-Pu曲C级较Child-PughA级患者HBF差异有统计学意义(P＜0.05)，与Child-PughB级比较差异无统计学意义(P＞0.05)；Child-PughA级、Child-PughB级和Child-PughC级患者与正常组比较MTT差异均存在统计学意义(P＜0.05)，Child-PughB级、Child-PughC级患者与Child-PughA级相比MTT差异有统计学意义(P＜0.05)，Child-PughB级和Child-PughC级患者相比MTT差异有统计学意义(P＜0.05)。10．肝硬化病人肝左叶与肝右叶CT灌注参数的比较肝硬化病人肝左叶与肝右叶CT灌注参数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。11．肝硬化所致肝脏容积变化与灌注参数间的相关性HAP和MTT与LV呈负相关(r=-0.454，P＜0.05；r=-0.656，P＜0.05)；HPP、HBF与LV呈正相关(r=0.745，P＜0.05；r=0.668，P＜0.05)。结论1．兔早期肝硬化模型的建立为有关早期肝硬化方面的临床研究提供了理论基础。2．肝脏CT灌注参数可定量测定肝脏血流变化，可反映早期肝硬化形成过程中的肝脏血液动力学变化。肝脏血流灌注参数的改变为临床诊断、治疗早期肝硬化和评价其愈后提供了客观依据。3．HIF-1α、VEGF在肝炎期、肝纤维化期、早期肝硬化期的表达是依次增强的，而且在早期肝硬化中阳性表达数最高。4．HIF-1αmRNA、VEGFmRNA的表达水平从第2周末至第12周末是依次增加的。5．早期肝硬化形成过成中，CT灌注参数与HIF-1α、VEGF表达的相关性：HAP、MTT和HIF-1α、VEGF的表达呈正相关(r=0.532，P＜0.05；r=0.381，P＜0.05)；HPP、HBF和HIF-1α、VEGF的表达呈负相关(r=-0.721，P＜0.05；r=-0.687，P＜0.05)。6．肝脏血流灌注参数能够反映肝硬化患者的严重程度。7．肝硬化患者肝左叶与肝右叶CT灌注参数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。8．肝硬化时肝容积的变化与肝脏血流灌注参数的相关性：HAP和MTT与LV呈负相关(r=-0.454，P＜0.05；r=-0.656，P＜0.05)；HPP、HBF与LV呈正相关(r=0.745，P＜0.05；r=0.668，P＜0.05)。