人类基因组草图和基因组甲基化扫描提示人类11号染色体上有一个与白血病发病相关的甲基化位点，其下游部位存在磷酸化应激诱导蛋白(Stress Induced Phosphoprotein Ⅰ，STIP1)基因，磷酸化应激诱导蛋白是一个重要的伴侣分子，含有由三十四个氨基酸组成的重复序列(tetratricopiptide repeats，TPR)，人体内某些蛋白质如蛋白磷酸酶5(PP5)、免疫亲和素(FKBP51、FKBP52和Cyp40)、细胞周期蛋白(cdc基因)、热应激蛋白70和90(Hsp70、Hsp90)等也含有类似序列的结构域；磷酸化应激诱导蛋白的两端分别与Hsp70和Hsp90相连，可能对于肿瘤细胞发生、应激反应、甾体激素作用和细胞增殖分化等均具有重要的调节作用。 为克隆磷酸化应激诱导蛋白的全长序列，采用了cDNA末端扩增方法和长距离聚合酶链反应，分别扩增该基因的5’末端、3’末端和中间部分的序列，经产物纯化、与载体连接、阳性克隆筛选、测序证实，克隆了该基因的全长cDNA序列。通过生物信息学方法与已知的磷酸化应激诱导蛋白序列基本区域匹配(BLAST)分析发现，测序证实我们克隆到的该基因序列，不仅包含有原有序列，而且将其5’端的序列进一步延伸，此延伸序列恰恰是该基因的一个外显子，可以用于该基因mRNA转录本表达的研究；该基因全长序列的克隆为在培养细胞系中研究磷酸化应激诱导蛋白表达、定位和功能研究，奠定了可靠的基础。 为研究磷酸化应激诱导蛋白的表达、定位和功能，采用了长距离聚合酶链反应扩增含有开放阅读框架的靶片段，经产物纯化、与载体连接，分别构建了STIP1基因的原核表达载体和真核表达载体；IPTG诱导原核表达载体，变性聚丙酰胺凝胶电泳与染色后，可见相应大小的蛋白质表达；STIP1基因的真核表达载体转染细胞系后，共聚焦显微镜下观察STIP1蛋白主要分布于细胞核内；用药物 解放军总医院军医进修学院 博士学位论文 筛选STIPI基困转染的细胞后，流式细胞仪检测细胞周期，可见G。－G；期和G；－ M期的细胞明显脓，S期细胞明显增多。磷酸化应激诱导蛋白作为姊wR结 构域的一个核蛋白，是一个重要的分子伴侣蛋白，可能与体内椭类似结构鞭 功能各异的蛋白质相互作用，STIPI原核表达载体的构建，为研究该蛋白质与其 它蛋白质之间的相互作用提供了前提条件。磷酸化应激诱导蛋白可以使增殖期的 细胞明显增多，可能和肿瘤细胞的发生或恶性变有一定的关系，值得进一步研 究。 为研究原代白血病细胞磷酸化应激诱导蛋白基困转录本的表达，采用了逆 转录触…方法。贩，STIPI基固原有序列的12个外显子与X染色体 上的一段ON人序列完全匹配，不利于设计引物扩增所需要的片段。我们用生物信 息学方法，坝申盯1N基困的5’端序列，该序列为盯In基困的一个外显子， 且与x染色体上的mA序列不匹配，没计引物扩增，相应的靶片段，克隆测序证 实该序列与组装的序列一致；同时，STIPI基困5’CDNA末端扩增的实验结果， 也发现了相同的STIPI基固外显子。原代白血病细胞STIPI基困InRNA的表达存 在明显差异，复发组白血病患者较初友未用药者STIPI基困InRNA表驭达量明 显增高；初发未用药急性淋巴细胞白血病者的InRNA表达量较初发未用药急性髓 细胞白血病者明显增高；原代白血病细胞和部分肿瘤细胞系STIPI基困的mRNA 表达量较正常人的外周血单个核细胞、骨髓细胞和动员后的外周血干细胞均增 高。提示，原代白血病细胞和部分肿瘤细胞系STIPI基困MNA的过度表达，可 能和肿瘤的发生或恶性变有一定关系；磷跳应激诱导蛋白，不仅参与调节热应 激蛋白70和90的功能，而且与体内的多种蛋白质相互作用，可能是体内的一个 重要靶点，有可能用于某些疾病的干预治疗。 总之，抑究克隆了磷酬应俯导蛋白基因切A的金长序列，首次发现5 该基困的一个外显子，结合生物信息学的方法，用于检测STIPI基因InRNA转录 本的表达；通过构建STIPI原核细胞和真核细胞的表达载体，表湖＠应大小的蛋 5 解放军总医院军医进修学院 博士学位论文 白质，亚细胞定位破定该蛋白质是一个核蛋白，且可以明显增加转染细胞S期的 细胞数量；在原代白血病细胞中STIPI基固转录本的表达量存在明显差异。磷酸 化应激诱导蛋白作为调节体内多种蛋白质功能的伴侣分子，可能是疾病治疗的一 个重要的靶点，值得进一步研究。