背景：神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的肿瘤,占成年人颅内肿瘤的35%～50%。而恶性神经胶质瘤占所有胶质瘤的60%。由于其呈浸润性生长,单纯手术切除往往难以根治,且术后复发率高,平均生存期仅14个月。目前,除手术干预及辅助放疗,化疗和生物治疗仍是治疗神经胶质瘤的主要策略。只有小部分患者能从增加替莫唑胺治疗剂量中获益,而大剂量的替莫唑胺无疑加大了药物对人体的毒性作用。胶质瘤对多种抗肿瘤极易产生耐药,化疗药物的使用也未能延长患者的中位生存期。因此有必要寻找一种新的治疗药物并探索其机制,以期提高对胶质瘤的治疗疗效。甘草酸(Glycyrrhizin,即Glycyrrhizic acid)是从植物甘草中提取的天然五环三萜类化合物,通常用于预防和治疗慢性病毒性肝炎。研究发现,甘草酸有抗溃疡、祛痰、抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗癌、神经保护和增强机体免疫力的功效。在多种肿瘤细胞细胞系中,如肝癌、白血病、胃癌、及前列腺癌,甘草酸还可以通过下调NF-κB (p65)的表达诱导凋亡过程。还可以提高多种抗肿瘤药物,如环磷酰胺、长春新碱、喜树碱的抗癌活性,并可降低化疗药物的毒副作用。早在上世纪50年代末至60年代初就发现甘草酸有明确的抗肿瘤作用。然而,甘草酸是否有抗胶质母细胞瘤的作用,国内外尚未见报道。体内外的研究表明,核因子κ. B (nuclear factor kappa B, NF-κB)是一种关键的多显性核转录因子,广泛分布在细胞中,属于Rel基因家族,参与多种疾病的病理过程,控制胶质瘤扩散及高级别胶质瘤生长的基因也接受NF-κB的调控。越来越多的证据表明NF-κB在包括胶质瘤在内的多种肿瘤细胞中持续激活。在所有时期的星形细胞瘤细胞及高级别的星形细胞瘤中均能检测到活化的NF-κB。且在复发的胶质瘤细胞中,NF-κB的活化水平明显高于原发的胶质瘤,提示NF-κB可能与胶质瘤复发相关。更重要的是,活化的NF-κB能够激活多种基因的转录,包括编码细胞因子和粘附因子的基因,及决定肿瘤发生和发展的基因。NF-κB活化主要是通过p50/p65亚基组成的二聚体脱离与抑制性κB蛋白的结合,并转移到细胞核内实现。Fas-L、IFN-β、IL-8和IP-10基因的启动子及HIV-1基因的增强子是NF-κB最常见的DNA结合位点。核转录因子NF-κB与胶质瘤的发生、发展、浸润、转移、复发、凋亡、免疫应答等密切相关,并且甘草酸能通过下调P65的表达诱导前列腺癌细胞系凋亡。因此,我们研究甘草酸处理U251细胞后NF-κB活性亚基p65蛋白在细胞核中的改变。目的：观察甘草酸(Glycyrrhizic acid, GA)对人神经胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响,并通过检测NF-κB活性亚基p65在细胞核内表达的变化,探讨甘草酸抑制胶质瘤增殖的可能机制,为进一步研究甘草酸治疗胶质瘤提供理论基础和实验依据。方法：1、细胞培养：人胶质瘤母细胞系U251复苏后在含10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM培养基中于37。C、5%C02培养箱中培养,隔天换液,3-4天传代一次,用于实验的细胞均处于对数生长期。2、CCK-8法检测细胞生存率：取对数生长期的细胞,胰酶消化后混悬,细胞计数板计数后,接种于96孔板,每孔100μl,含3×103个细胞。待细胞贴壁后,将细胞培养液更换为空白对照液和不同浓度的甘草酸溶液,各实验组甘草酸浓度为1、2、4mmol/L,每组3个复孔,置于37。C、5%CO2培养箱中培养,分别于培养24、48、72h更换为DMEM培养基,同时每孔加入10u l CCK-8溶液,恒温培养箱内孵育2h,用全自动酶标仪在波长450nm处读取各孔光密度(OD)值。实验重复三次,并计算其平均值,细胞生存率计算公式如下：细胞生存率=(实验组OD值—本底组OD值)／(对照组OD值—本底组OD值)×100%,绘制生长抑制曲线图,并作统计学分析。3、平板克隆实验：克隆形成是测定细胞增殖能力的常用方法,单个细胞在体外传代6次以上形成的细胞群成为克隆,一个克隆的大小约0.3-1.Omm,本实验采用平皿法,用含EDTA的胰酶将处于对数生长期的细胞消化为单细胞悬液,并以每孔300个细胞的密度接种于25cm2的塑料培养皿中。细胞在含有不同浓度甘草酸(0、1、2、4mmol/L)的细胞培养液中孵育10天后,弃去培养基,用PBS洗2次后,甲醇固定30分钟,冲洗后予龙胆紫染色,100倍显微镜下计数培养皿中所有紫色斑点。4、细胞凋亡检测：根据细胞生存率结果,选取48小时作为检测细胞凋亡的特定时间点。4.1、倒置相差显微镜下观察细胞形态,Hoechst33258染色U251细胞,荧光显微镜下观察细胞核形态：PBS冲洗细胞3次,对照组及甘草酸处理组细胞予Hoechst33258室温黑暗环境下染色l0min。再次予PBS冲洗细胞3次后,340nm波长的荧光显微镜下拍照并观察细胞核形态学变化。4.2、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率：离心细胞,预冷的PBS冲洗,用100μl的结合缓冲液重悬细胞,各组加入2μlAnnexin V-FITC及2μ1的碘化丙啶的混合液,4。C黑暗环境下孵育15min后立即在流式细胞仪中行计数分析,记录每组早期凋亡及晚期凋亡细胞所占百分数。5、蛋白免疫印迹检测：不同浓度的甘草酸(0、1、2、4mM)处理U251细胞48小时,收集各组细胞核蛋白。按每泳道50u g蛋白质上样,经8%的SDS-PA分离电泳蛋白质,湿转致聚偏氟乙烯膜,5%脱脂奶粉封闭,以兔抗人P65抗体一抗4。C过夜,洗膜数次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时,用增强的发光液可视化蛋白质条带,并行X线胶片曝光,UN-SCAN-IT凝胶分析软件获取条带显影密度,并计算各条带密度与相应内参histone H3的比值。6、免疫荧光检测：U251细胞接种至96孔板,2mmol/L的甘草酸处理48小时,4%多聚甲醛固定细胞,随即以10%的山羊血清封闭1小时。P65抗体4。C过夜孵育,次日PBS冲洗3次,每次20分钟,以含有Alexa Fluor488荧光的山羊抗兔抗体(1：500)孵育,同时用DAPI着色细胞核,并在荧光显微镜下拍照。7、统计学分析：统计学分析采用SPSS16.0数据统计软件。除特殊说明外,含有误差线(均数±标准差)的数据代表三次实验的结果。统计方法采用单因素方差分析,以p<0.05表示差异有统计学意义。结果：1、甘草酸抑制U251细胞增殖及克隆形成能力：1.1、甘草酸呈剂量和时间依赖性抑制U251细胞增殖：甘草酸作用24、48、72小时对U251细胞的半数抑制浓度分别为3.67、1.37、1.09mmol/L;1.2、U251细胞种植在25cm2塑料培养皿中并培养10天后,0、1、2、4mmol/L的甘草酸对U251细胞的克隆抑制率分别为91.6±4.4、81.2±5.0、45.5±5.1和30.7±6.5%,提示甘草酸对U251克隆形成的抑制能力有浓度依赖性趋势。2、甘草酸诱导U251细胞凋亡：采用Hoechst33258染色及流式细胞术观察甘草酸诱导U251细胞凋亡。2.1荧光显微镜及倒置相差显微镜分别用以观察细胞核和细胞整体形态的改变。正常对照组细胞呈不规则梭形,突触较多,折光度好,胞浆丰富,边缘清晰,与培养皿黏合紧密。细胞核均匀着色,2mmol/L甘草酸处理48小时后,多数细胞变圆、皱缩、变圆毛刺、折光度降低,细胞核碎裂,可见典型的凋亡小体。以上形态学的改变提示甘草酸有诱导U251细胞凋亡的作用。2.2、流式细胞术检测细胞凋亡率：0、1、2、4mmol/L的甘草酸处理U251细胞48小时后细胞凋亡率分别为：3.30±0.98、14.97±2.67、27.53±5.51和55.90±5.1%,可见细胞凋亡率随甘草酸浓度的增加而增加。3、甘草酸处理后,p65蛋白在U251细胞中的表达及分布：蛋白免疫印迹结果提示p65蛋白在对照组呈较高表达(2.83±0.38),而在甘草酸处理组,p65蛋白表达显著降低(1.91±0.31,1.43±0.28,0.94±0.22),各甘草酸处理组与对照组的蛋白表达水平在统计学上具有显著差异(1mM, P<0.05;2mM, P<0.01;4mM, P<0.01)。此外,采用抗p65抗体的免疫荧光结果显示对照组细胞核p65的荧光强度较强,而2mmol/L的甘草酸处理48小时后,U251细胞核p65的荧光强度变弱。结论：我们的实验结果发现甘草酸通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡发挥对人胶质母细胞瘤U251细胞的抑制作用。这些发现为甘草酸治疗胶质瘤的临床药物研究提供依据。除此之外,甘草酸对NF-κB抑制作用为对抗NF-κB相关疾病提供新的治疗策略。