背景和目的:糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的一种严重并发症,也是导致成人视力损害和失明的主要原因之一。已有研究表明,炎症可损伤视网膜的结构和功能,因而在促进DR的发生和发展中起重要作用。由于视网膜没有完整的淋巴管系统以及由于血视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)的存在,因此一般认为淋巴细胞不会出现在视网膜组织中产生特异性的免疫炎症反应。这样,目前对于DR炎性事件的研究主要是针对视网膜单核巨噬细胞和胶质细胞介导的非特异性免疫反应,而对于淋巴细胞介导的特异性免疫反应在DR中的作用仍知之甚少。白介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)是由T淋巴细胞分泌的促炎细胞因子,它在自身免疫性疾病和炎症性疾病的致病机制中起重要作用。我们实验室已报道,在糖尿病病人的血浆中,IL-17水平升高,提示IL-17可能与DR有关。为此,本研究结合应用体外和体内实验以及几种DR动物模型说明IL-17A对DR的作用、作用靶点及信号转导途径,为DR的炎性致病机制提供新的思路,也为临床上潜在应用IL-17A中和抗体辅助治疗DR提供基础实验资料。方法:(1)Ins2Akita(Akita)小鼠糖尿病发病后的第13-14周以及链脲霉素(streptozotocin,STZ)诱导小鼠糖尿病发病后的第13-14周作为两种DR模型。(2)将IL-17A敲除的小鼠与Akita小鼠杂交获得IL-17A缺陷的Akita小鼠,该小鼠在糖尿病发病后的第13-14周为IL-17A缺陷Akita小鼠DR模型。(3)在Akita DR小鼠的玻璃体腔内注射IL-17A(8 ng/2 μl/eye或40 ng/2μl/eye)或注射携带Act1基因干扰的腺病毒载体Ad-Act1-shRNA(注射Ad-GFP作为对照)。在IL-17A注射后第3天,或在Ad-Act1-shRNA注射后第3周,进行以下8-15项中相关指标的检测,其中视网膜血管造影都是在玻璃体内注射后第3周进行。(4)在STZ诱导的DR小鼠玻璃体腔内注射IL-17A中和抗体(2 μg/2 μl/eye或 10μg/2μl/eye)或注射 IL-17A 受体(IL-17RA)中和抗体(0.4μg/2 μl/eye 或2 μg/2 μtl/eye),同时注射同等量的PBS作为对照。在注射后第3天,进行以下8-15项中相关指标检测,其中视网膜血管造影是在玻璃体内注射后第3周进行。(5)高糖(15 mM或25 mM)条件下培养大鼠Müller细胞株(rMC-1)和大鼠视网膜原代Müller细胞48小时,作为两种DR的细胞模型。(6)高糖培养的 rMC-1 用 IL-17A(I0 ng/ml、25 ng/ml 或 50 ng/ml)、IL-17A中和抗体(1 μg/ml或2 μg/ml)或IL-17RA中和抗体(1 μg/ml)处理24小时,然后进行以下8-15项中相关指标的检测。(7)高糖培养的原代Müller细胞用IL-17A(25 ng/ml)、IKK抑制剂Wedelolactone(Wedel,10 μM)或 Ad-Act1-shRNA(Ad-GFP 作为对照)处理 24小时,然后进行以下8-15项中相关指标的检测。(8)用 Western blot 法检测视网膜和 Müller 细胞表达 IL-17A、IL-17RA、GFAP、VEGF、GS、EAAT1、Act1、TRAF6、occludin 和 ZO-1 的水平,以及 NF-κB 和caspase-3的活化水平。(9)用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测视网膜匀浆、Müller细胞匀浆及Müller细胞培养上清液中IL-17A、GFAP和VEGF的含量或浓度。(10)用高效液相色谱(HPLC)分析视网膜内和Müller细胞内谷氨酸的含量。(11)用荧光免疫组织化学观察视网膜内GS(Müller细胞标志物)与IL-17A、IL-17RA或VEGF的共表达,以及NeuN(神经细胞标志物)与IL-17A或IL-17RA的共表达。(12)用异硫氰酸荧光素结合的刀豆蛋白A(FITC-Con A)来标记粘附于视网膜血管壁的白细胞,然后计数每个视网膜内粘附的白细胞数。(13)用FITC-dextran进行视网膜血管造影,观察FITC-dextran渗出视网膜血管的程度。(14)用免疫荧光染色和TUNEL结合的方法评价视网膜神经节细胞的凋亡。(15)用透射电子显微镜观察视网膜神经节细胞凋亡的超微结构。结果:(1)在Akita小鼠糖尿病发病后的第13-14周以及在STZ诱导小鼠糖尿病发病后的第13-14周,它们的视网膜表达IL-17A和IL-17RA均上调,并且视网膜内IL-17A含量增高。(2)Akita DR小鼠的视网膜中GS与IL-17A或与IL-17RA均有共定位,但NeuN与IL-17A或IL-17RA均没有共定位。(3)高糖处理rMC-1后,其表达IL-17A和IL-17RA的细胞数增加,表达IL-1 7A和IL-17RA上调,以及分泌IL-17A增加。同样,高糖处理原代培养的视网膜Müller细胞后,其表达和分泌IL-17A增加,并且表达IL-17RA上调。(4)IL-17A处理高糖培养的rMC-1增加了 GFAP的表达和生成、VEGF的表达和分泌、以及谷氨酸的产生,但下调了 GS和EAAT1的表达。相反,IL-17A中和抗体或IL-17RA中和抗体处理高糖培养的rMC-1均减少了 GFAP的表达和生成、VEGF的表达和分泌、以及谷氨酸的产生,但上调了 GS和EAAT1的表达。同时,IL-17RA中和抗体阻断了 IL-17A的上述作用。(5)IL-17A增强了高糖诱导的原代Müller细胞表达Act1和TRAF6以及活化p65;而Ad-Act1-shRNA减弱了高糖诱导的Müller细胞内Act1-TRAF6-p65信号通路的活化,也抑制了 IL-17A增强该信号通路活化的作用;此外,Wedel阻断了高糖和IL-17A激活p65的作用。(6)IL-17A加重了高糖诱导的原代Müller细胞表达和生成GFAP、表达和分泌VEGF、以及产生谷氨酸,并下调了 GS和EAAT1的表达;而Ad-Act1-shRNA和Wedel均减轻了高糖诱导的上述变化,也抑制了 IL-17A对Müller细胞的损伤作用。(7)Akita DR小鼠的视网膜表达Act1和TRAF6以及活化p65的水平均增加。该小鼠玻璃体腔内注射IL-17A进一步增强了视网膜内Act1和TRAF6的表达以及p65的活化。相反,Akita DR小鼠的玻璃体内注射Ad-Act1-shRNA减弱了视网膜内Act1-TRAF6-p65的活化水平。(8)Akita DR小鼠的玻璃体腔内注射IL-17A导致了视网膜内GFAP和VEGF的表达上调、GS和EAAT1的表达下调、GS与VEGF的共表达增强、谷氨酸的含量增加、血管粘附白细胞的数目增多、血管渗漏加重、神经节细胞层中NeuN/TUNEL双阳性细胞数和NeuN/Caspase-3双阳性细胞数增加。相反,Akita DR小鼠的玻璃体腔内注射Ad-Act1-shRNA导致了视网膜内GFAP和VEGF的表达下调、GS和EAAT1的表达上调、GS与VEGF的共表达减弱、谷氨酸的含量减少、血管粘附白细胞的数目降低、血管渗漏减轻、神经节细胞层中NeuN/TUNEL双阳性细胞数和NeuN/Caspase-3双阳性细胞数减少。(9)在STZ诱导的DR小鼠的玻璃体腔内注射IL-17A中和抗体或IL-17RA中和抗体与注射PBS比较,其视网膜内GFAP和VEGF的表达下调、GS和EAAT1的表达上调、GS与VEGF的共表达减弱、谷氨酸的含量减少、血管粘附白细胞的数目降低、occludin和ZO-1的表达上调、血管渗漏减轻、神经节细胞层中NeuN/TUNEL双阳性细胞数减少、神经节细胞凋亡的超微结构特征改善。(10)与Akita DR小鼠比较,IL-17A缺陷的Akita DR小鼠的视网膜内GFAP和VEGF的表达下调、GS和EAAT1的表达上调、谷氨酸的含量降低、血管粘附白细胞的数目减少、ZO-1的表达上调、血管渗漏减轻、神经节细胞层中NeuN/TUNEL双阳性细胞数减少、Caspase-3的活性减弱。结论:(1)DR诱导视网膜产生IL-17A并激活视网膜内IL-17A相关的炎性信号通路IL-1 7RA-Act1-TRAF6-NFκB,Müller细胞在这些变化中起重要作用。(2)IL-17A通过激活IL-17RA-Act1-TRAF6-NFκB炎性信号通路加重了 DR的病理特征,包括Müller细胞的活化和功能损伤、BRB的破坏和视网膜血管的渗漏、以及视网膜神经节细胞的凋亡。其中Müller细胞是介导IL-17A对DR作用的重要靶细胞。(3)IL-17A中和抗体处理及IL-17A缺陷Akita小鼠均减轻了 DR的病理特征,进一步说明IL-17A在DR的炎性致病机制中起重要作用,也为临床上潜在应用IL-17A中和抗体辅助治疗DR提供实验证据。