何首乌（Fallopia multiflora）属于蓼科多年生缠绕草本植物，其块根（何首乌）和藤茎（夜交藤）均可入药。何首乌提取物中含有多种对人类健康有益的活性成分，如黄酮类、蒽醌类等。其中最重要的是以二苯乙烯苷（2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）为代表的芪类化合物。中国药典以其作为何首乌理化鉴定的主要标准，规定其含量不低于1%（干重）。药效学研究证实，二苯乙烯苷在降血脂、抗衰老、保护心血管及抗动脉粥样硬化方面都有很好的应用前景。在已有的研究中，二苯乙烯类母核的合成被归为二苯乙烯、二芳基庚酸类和姜酚合成路径（Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerolbiosynthesis，KEGG pathway：map00945）。一般认为二苯乙烯类是由苯丙氨酸途径经由苯丙素途径合成，三羟基芪白藜芦醇和四羟基芪白皮杉醇等均由此路径合成。然而，作为四羟基芪糖苷衍生物的二苯乙烯苷，其生物合成途径的研究还未见报道。本课题首先采用抑制消减杂交的方法，从二苯乙烯苷含量差异悬殊的何首乌样本中筛选可能与二苯乙烯苷合成相关的基因，而后又对何首乌块根进行了转录组测序和4个样本的数字表达谱分析，通过对差异表达基因功能及代谢路径的分析表达水平的检测，初步提出了由酪氨酸经由香豆酰辅酶A合成二苯乙烯苷的推论。具体的研究内容及结果如下：⑴收集了全国13个产地的何首乌样本，HPLC检测二苯乙烯苷含量显示：不同产地何首乌二苯乙烯苷含量差异悬殊，桂林产何首乌二苯乙烯苷含量最高可达6.37%（干重），而重庆、江西新余和广西靖西产何首乌二苯乙烯苷含量均不足0.1%。即使同一产地，二苯乙烯苷含量亦差异甚大，如桂林何首乌，高低差距可达5倍。何首乌不同组织间二苯乙烯苷含量以块根最大，藤茎次之，叶片最少。⑵取二苯乙烯苷含量最高的桂林何首乌和含量最低的重庆何首乌进行了3组抑制消减杂交：Ⅰ，以桂林叶子为测试子，桂林块根为驱动子；Ⅱ，以桂林块根为测试子，重庆块根为驱动子；Ⅲ，以重庆块根为测试子，桂林块根为驱动子。筛选出的差异基因经连接载体测序，桂林叶片测试子组得到差异基因5个，桂林块根测试子组得到差异基因4个，重庆测试子组得到差异基因7个（其中4个为与桂林叶片测试子组相同）。经比对到NCBI和KEGG数据库，其中YCTS1和CTS1可能以编码过氧化氢酶的形式参与了次生代谢以及色氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢等。YCTS1和CTS1中色氨酸代谢相关的酶反应活跃，暗示其中二苯乙烯苷含量较低可能是由于分支酸到色氨酸的代谢较为旺盛，竞争性抑制了分支酸到苯丙氨酸的代谢。从块根中分离的GTS1则可能以photosystem II oxygen-evolving enhancer protein2的形式参与了基础代谢和光合作用。⑶对在NCBI数据库未找到匹配基因的4个抑制消减杂交片段进行cDNA末端快速扩增（RACE），以期获得更多的序列信息。其中GE和CF片段各得到1个全长序列，GW得到3个可能的全长序列，CA得到2个可能的全长序列。经过NCBI ORF Finder查找全长序列的开放读码框，7个全长序列均存在完整的读码框信息。⑷以何首乌地道产的德庆何首乌块根和重庆何首乌块根为样本，进行转录组测序，共得到unigene65,653条。比对到Nr，Nt，SwissProt，KEGG，COG，GO库，总共73.38%的基因返回有注释结果。代谢通路分析显示，有204条基因参与到二苯乙烯类、二芳基庚酸类和姜酚合成路径。与二苯乙烯类合成密切相关的苯丙素合成，则涉及有391条基因。116条基因涉及到了苯丙氨酸和酪氨酸合成。18条基因具有聚酮合酶活性。⑸以块根转录组序列为参考基因库，对德庆何首乌块根、藤茎、叶片和重庆何首乌块根进行数字表达谱分析。取唯一匹配到参考基因库的标签进行表达量注释，4个DGE样本分别注释17,884（Cr），16,197（Dr），14,643（Dl），16,457（Ds）个基因。而后对样本之间的差异基因进行了表达模式聚类分析、GO功能富集分析和代谢路径富集分析。代谢路径富集分析显示16条基因参与了二苯乙烯类合成、二芳基庚酸类和姜酚合成路径，29条基因参与了苯丙素合成，17条参与了苯丙氨酸代谢。⑹在数字表达谱分析的基础上，对21个可能与二苯乙烯苷合成相关的基因采用RT-PCR技术进行了基因表达水平的检测，得出二苯乙烯苷是由酪氨酸起始，经由香豆酰辅酶A合成的结论。本文主要采用抑制消减杂交、转录组测序和数字表达谱的方法，对何首乌中二苯乙烯苷合成路径相关的基因进行了较为全面的筛选研究，提出了二苯乙烯苷合成的酪氨酸途径以及列举了可能参与二苯乙烯苷合成的酶基因，为二苯乙烯苷合成路径的研究指明了方向，并为何首乌中其他次生代谢研究及组织发育研究提供了坚实的平台。