在中国,中华绒螯蟹是极受欢迎的美食,近几年大闸蟹的人工养殖产量逐年快速增长,成为水产经济养殖重要组成部分。但随着水产养殖集约化的提高,抗生素不断滥用,导致环境污染,病害加重,新的抗菌方法或者替代品急需被研制出来以减少抗生素的使用。人和动物的体表和体内含有数量庞大物种极多结构复杂的微生物,这其中肠道细菌数量和种类又是最多的。目前研究发现,肠道细菌主要在消化吸收、免疫系统和新陈代谢等方面协助人体肠道发挥作用。水产动物的肠道中同样拥有复杂的微生物系统,针对鱼类的肠道微生物研究较为充足,功能与人类肠道细菌相似。然而虾蟹类肠道细菌的研究仍在初级阶段,螃蟹的肠道细菌研究仅有三篇报道,优势菌属于柔膜菌门(Tenericutes),拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。但这些研究样品量少,所得结果不能统一,核心菌属难以确定,因此,对中华绒螯蟹肠道微生物的研究仍需更加深入。如果能够透彻研究肠道微生物的功能,就可以找到益生菌,从而利用这些益生菌来帮助人或者动物更好得生存。目前,某些细菌,例如乳酸菌或双歧杆菌等作为益生菌添加在人类的食品中,来促进人类的肠道或其他功能。而在水产养殖中,枯草芽孢杆菌和梭菌属等作为益生菌也已经在饲料中应用。但不同物种肠道结构不同,肠道微生物也有所不同,应用通用的益生菌制剂并不能完全发挥作用,因此能够找到中华绒螯蟹肠道益生菌并将其利用在螃蟹养殖中去,对水产养殖是极大的贡献。本文旨在研究中华绒螯蟹肠道微生物多样性从而找到核心菌群,并检测这些核心菌的来源,为后面学者研究肠道益生菌并应用在水产养殖中提供理论基础。本文通过现在流行的高通量测序以及DGGE测序技术来初步了解中华绒螯蟹肠道微生物的多样性,而这些研究方法都是以PCR为基础而建立的,因此合适的PCR引物,对结果的准确性有极大的影响。本文首先对应用广泛的细菌16S r RNA基因通用引物357F/518R的特异性进行验证,发现其有非特异性扩增。经进一步实验分析发现V3区引物可以扩增多种动物的18S r RNA基因,而在现有的NCBI Genbank中也发现经V3区引物扩增而得到到动物18S r RNA序列被误认为细菌的16S r RNA序列而上传。本文经过Silicon分析以及实验验证,讨论不同的细菌16S r RNA的特异性与覆盖率,最终确定V1-V3区引物为特异性较好对细菌覆盖率最高,适合应用在DGGE上,而V1-V2区引物适合应用在宏基因组扩增中。应用DGGE分析三只螃蟹的中后肠细菌,共得到17条不同条带,经割胶测序分析这些序列属于柔膜菌门(Tenericutes),拟杆菌门(Bacteroidetes),厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)。而通过宏基因组测序技术发现柔膜菌门(Tenericutes),拟杆菌门(Bacteroidetes),变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)为肠道中优势门类,总量超过95%,而其他较少的门类主要是Actinobacteria,Chloroflexi,Acidobacteria和Cyanobacteria。在属水平上,这些门下主要有10种不同的优势OTU,分别是Bacteroides,Dysgonononas,Sunxiuqinia,CMC Mollicutes group 1,CMC Mollicutes group 2,Vibrio,Uncultured Streptococcaceae,Pseudomonas,Pantoea和Coprobacillus。而这些菌在中华绒螯蟹的中后肠都有存在,但分布有所不同。中华绒螯蟹肠道发现的Marinifilum fragile(属于拟杆菌门)同在韩国海水底泥中发现的Marinifilum有很高的匹配度。中华绒螯蟹肠道发现的拟杆菌属的细菌并未在其他动物肠道中发现相似性较高的细菌。这些拟杆菌属可能是中华绒螯蟹肠道特有的细菌,并且和螃蟹肠道具有特殊的关系。这些拟杆菌在螃蟹后肠的分布比在中肠稍多,但不同的个体之间也有差别。CMC Mollicutes group 1和CMC Mollicutes group 2可能是中华绒螯蟹肠道特有的常驻菌。CMC Mollicutes group 2和Candidatus Bacilloplasma还有Candidatus Lumbricincola有较近的亲缘关系,并且在中后肠中都有所发现。然而CMC Mollicutes group 1在中华绒螯蟹的中肠大量存在,这些细菌序列同在泥蟹(Scylla paramamosain)肠道中发现的uncultured Mycoplasmataceae序列有95%的匹配度,并且同在等足类海洋动物Ligia oceanica(Crustacea:Isopoda)的中肠中发现的共生菌uncultured Mycoplasmataceae的序列有超过96%的匹配度,因此CMC Mollicutes group 1可能与等足类动物中的Mycoplasmas起源于共同的祖先。而这两株菌极有可能是在中华绒螯蟹肠道切片电镜中发现分布具有柄基结构和菌毛状结构细菌。为了进一步验证这些菌是否为中华绒螯蟹肠道核心菌群,即是否能够在不同养殖地点的螃蟹中都有存在,q PCR检测了来自中国七个省市的9个不同养殖场的螃蟹肠道样品。应用设计的5类优势OTU特异性的引物所得拷贝数和细菌通用引物所得拷贝数的比例计算细菌在样品中的含量。结果发现Bacteroides,Sunxiuqinia,Mollicutes group 1和Mollicutes group 2能够在多数样品中检测到,并且含量较高,为中华绒螯蟹肠道核心菌群。经对螃蟹养殖水体和食物检测发现,Marinifilum来源是食物和水体,并不能长期存在于螃蟹的肠道中,不属于核心菌群。而Sunxiuqinia可能来源于水体并在肠道中常驻,并且在所有样品中有检测到,含量较为稳定,是优势的核心菌。而Bacteroides,Mollicutes group 1和Mollicutes group 2则是中华绒螯蟹肠道特有的微生物,在其他环境中未发现,有可能是由亲代传给后代,并非来源于环境。在q PCR分析时发现四种核心菌在后肠的含量都比中肠高,可能的原因是食物中的杂菌随着中肠到后肠数量逐渐减少,从而导致后肠的核心菌含量增高。