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目的:通过观察不同程度的丝线结扎对坐骨神经慢性压迫损伤(CCI)模型实验大鼠疼痛行为学的影响,为CCI模型的建立提供新的依据。其次观察不同剂量大黄素对CCI模型行为学的影响,包括自发性疼痛评分、机械缩足反射阈值(MWT)和足底热痛觉阈值(TWL)以明确其镇痛作用;为进一步探究大黄素镇痛靶点,运用蛋白质组学技术筛选出不同处理组间差异表达蛋白,进行生物学信息分析,并对相关差异蛋白进行验证,从而初步探索其“以通治痛”的分子机制。方法:1.不同程度丝线结扎对CCI模型行为学影响:将80只SD雄性大鼠随机分为四组:假手术组(S组)、松扎组(L组)、适中组(M组)及紧扎组(T组),并于术前、CCI术后D3、D7、D15、D21进行MWT及TWL值测定。2.不同剂量大黄素对CCI模型行为学影响:将162只SD雄性大鼠随机分为6组,分别为大黄素高剂量组、中剂量组、低剂量组、CCI模型组、普瑞巴林组及假手术组,每组27只。术后第1天开始高、中、低剂量组分别予100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg大黄素混悬液进行灌胃,日一次,连续15天;而普瑞巴林组则以15mg/kg药量灌胃。同时于术前及术后D3、D7、D11、D15不同时间点进行疼痛行为学测定包括自发性疼痛评分、MWT及TWL值。于术后15天行为学测试后取L4-L6术侧脊髓。3.大黄素在CCI模型中镇痛作用机制的相关研究:运用蛋白质组学技术筛选出假手术组、CCI模型组及中剂量大黄素组L4-L6术侧脊髓组织中差异表达蛋白,并将以上蛋白从基因本体论(GO)注释、聚类分析、京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析不同角度进行功能注解。4.脊髓组织差异蛋白的Western Blot和RT-PCR验证:运用Western Blot和RT-PCR技术对脊髓组织中与疼痛相关的差异表达蛋白,包括髓鞘蛋白P0(MPZ)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα(CAMKIIα)、降钙素(CALCA)、磷脂酶Cβ1(PLCβ1)、蛋白激酶C(PKC)、酪氨酸激酶B(TrkB)及突触融合蛋白1A(STX1A)进行蛋白表达和mRNA水平验证。结果:1.不同程度丝线结扎对CCI模型疼痛行为学影响:CCI术后,T组、M组、L组实验大鼠均表现出不同程度的术侧后足畸形、步态及姿势异常,但仅有T组大鼠伴有足背着地及运动障碍;而在L组大鼠中,疼痛所引发的异常表现较为短暂,第7天后基本消失。与S组相比,术后第3天,L组、M组及T组大鼠MWT及TWL值显著降低(P<0.01)。术后11天,L组实验大鼠MWT及TWL值基本恢复至术前水平,与S组相比,差异无统计学意义(P>0.05);在T组大鼠中,MWT及TWL值呈现缓慢恢复趋势,尤其是TWL值至术后21天与S组相比统计学无差异(P>0.05);在M组中,MWT及TWL值在观察期间维持在较低水平,与假手术组相比,具有显著统计学差异(P<0.01)。2.不同剂量大黄素对CCI模型行为学影响:术后第3天,CCI模型组,高、中、低剂量大黄素组及普瑞巴林组自发性疼痛评分显著升高而MWT及TWL值均降低,与Sham组相比差异有统计学意义(P<0.01);术后第7天开始,高、中剂量及普瑞巴林组自发性疼痛评分进行性下降而MWL及TWL值明显升高,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01),尤以中剂量及普瑞巴林组最为显著;给药15天后,低剂量大黄素组自发性疼痛评分降低而MWT值升高,与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.01),但TWL值升高不明显,与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。3.大黄素在CCI模型中镇痛作用靶点筛选:(1)运用蛋白质组技术,对假手术组、CCI模型组及中剂量大黄素组术侧L4-L6脊髓组织中差异表达蛋白进行定量分析,共鉴定出差异蛋白177个(>±1.2倍,P<0.05);其中CCI模型组与假手术组相比(M vs S)鉴定出差异蛋白102个,上调蛋白52个,下调50个;大黄素组与模型组相比(DM vs M)鉴定出差异蛋白109个,上调66个,下调43个。(2)对差异蛋白GO功能中的生物功能进行显著性富集分析,与CCI模型组相比,大黄素组上调蛋白富集于神经胶质细胞发育、星形胶质细胞分化及维生素转运等,分子功能富集于氧转运体活性、氧结合等;下调蛋白生物功能富集于突触信号释放、突触前过程、神经递质分泌及转运,分子功能富集于离子通道抑制活性、蛋白激酶活性、腺嘌呤核苷酸结合等。(3)与CCI模型组相比,大黄素组差异表达蛋白所富集的可能与疼痛相关的KEGG通路主要为长时程增强、钙离子信号途径、MAPK信号途径、5-羟色胺能突触信号、胆碱能突触传递、Wnt信号途径途径、cAMP信号途径、趋化因子信号途径、谷氨酸能突触传递、缝隙连接等。4.Western Blot技术对脊髓部分差异蛋白验证结果:与假手术组相比,模型组中CAMKIIα、CALCA、PKC、PLCβ1、TrkB及STX1A蛋白表达均上调;与CCI模型组相比,中药单体大黄素组中以上蛋白表达水平则呈现不同程度的下调趋势。在模型组中,MBP及MPZ蛋白的表达显著低于假手术组;而相比模型组,大黄素干预组以上两种蛋白表达上调。以上结果说明大黄素可以反向调节模型组异常表达蛋白,其与iTRAQ蛋白质组学筛查结果基本一致。5.RT-PCR转录水平对脊髓部分差异蛋白验证结果:与假手术组相比,CCI模型组中CALCA、TrkB、PLCβ1表达水平显著升高(P<0.01),而PKC及CAMKIIα表达未见明显差异(P>0.05);与CCI模型组相比,大黄素组以上五种蛋白表达均呈现下调趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。在CCI模型组MBP及MPZ转录水平显著低于假手术组(P<0.01);而相比模型组,大黄素干预组以上两种蛋白表达上调(P<0.01)。此外,与假手术组相比,CCI模型STX1A表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,大黄素干预后表达趋势下调,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.本课题在现有文献基础上,探讨不同程度丝线结扎对CCI模型行为学影响,结果发现适中组的结扎程度更适合制备CCI模型,即结扎时的线结需使神经微微塌陷,偶尔伴有局部肌肉轻度抖动,从而为CCI模型的建立提供新的证据。2.本实验进一步评估不同剂量大黄素对CCI模型行为学影响,结果发现大黄素能够显著改善神经病理性疼痛CCI模型大鼠的自发性疼痛、缓解机械痛觉过敏及热痛觉过敏,且尤以中剂量(50mg/kg)疗效最佳。3.为探究大黄素在CCI模型中的镇痛靶点,本实验采用蛋白质iTRAQ技术筛选出不同处理组差异表达蛋白,并进行生物学信息分析,结果发现大黄素可能通过影响长时程增强、谷氨酸突触传递、钙离子信号转导等多条途径发挥镇痛作用。4.运用Western Blot及RT-PCR技术对与疼痛相关的差异蛋白进行验证,结果发现大黄素一方面通过提高CCI模型脊髓组织中MBP及MPZ蛋白表达,促进髓鞘再生;另一方面可抑制PLCβ-PKC通路,降低CaMKⅡα及TrkB表达,减轻中枢敏化及神经元兴奋性,从而缓解疼痛。