戊型肝炎(hepatitisE，HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)引起的急性病毒性肝炎，具有发病急、症状重、死亡率高等特点[1]。HEV有4个主要的不同基因型(Ⅰ-Ⅳ型)，流行病学资料显示Ⅳ型HEV是引起我国散发性戊型肝炎的主要病毒株[2]。目前HE尚无有效的抗病毒治疗药物，因此HEV疫苗在HE防治中的作用受到人们的重视[3]。基因疫苗是一种倍受人们关注的新兴疫苗，具有制备简单、性质稳定，特别是具有可同时诱导特异性体液免疫和细胞免疫等优点，已用于HEV疫苗的研究[4]。我们在以往的研究中发现HEV中和抗原表位位于其基因组第二读码框架(openreadingframe2，ORF2)编码蛋白的第452-617位氨基酸之间[5,6]，鉴于中和抗原表位在诱导保护性免疫应答中的重要作用，本研究在获得了来源于一株第Ⅳ基因型的HEV毒株且含中和表位的抗原片段-p166、p179基因编码序列的基础上，构建了4种不同的真核重组表达质粒，体外转染真核细胞并局部注射小鼠肌肉组织，检测它们在体内、体外的抗原表达水平并探讨载体和目的基因的选择对抗原在真核细胞内表达的影响；将构建的重组质粒基因免疫小鼠，观察其免疫效果。 方法： 应用逆转录巢式PCR(RT-nested-PCR)法从一只感染HEV的弥猴的粪便悬液中扩增获得HEVORF2G6461～G7035基因编码序列，进行序列测定后与Genbank中已知的4个主要基因型的HEV代表株相应基因序列进行序列比对，以确定该HEV毒株的基因型；设计特异性引物，以ORF2G6461～G7035为模板，应用PCR法扩增HEV-p166和p179的基因编码序列；将此基因序列分别克隆入不同的真核表达载体pTR421和pCDNA3.1中，构建4种不同的真核重组表达质粒pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179，并进行双酶切鉴定和序列测定；应用脂质体介导法将己构建的4种不同的真核表达质粒体外转染HepG2人肝癌细胞并局部注射小鼠肌肉组织；应用免疫荧光法和Western-blotting法检测目的抗原在体外HepG2细胞中的表达水平；应用免疫组化法检测目的抗原在小鼠局部肌肉组织中的表达水平；将能够在体内和体外真核细胞中有效表达目的抗原的真核重组表达质粒pTR421-179基因免疫小鼠，定期眼眶采血，分离血清，间接ELISA法检测血清中特异性IgG抗体水平并观察其动态变化；分离pTR421-179基因免疫后小鼠的脾细胞，MTT法检测其在特异性抗原HEV-p179刺激下的增殖水平。 结果： 经序列测定和比对后确定该HEVORF2G6461～G7035序列来源于第Ⅳ基因型病毒株；获得了含中和表位的HEV-p166和p179目的抗原的基因编码序列；成功构建了4种不同的真核重组表达质粒pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179；免疫荧光和Western-blotting法可以检测到pTR421-179在体外转染的HepG2人肝癌细胞中表达的目的抗原，免疫组化法可以检测到pTR421-179在小鼠肌肉组织中表达的目的抗原；而应用同样的方法没有检测到其它3种重组质粒在体外转染的细胞中和体内小鼠肌肉组织中表达的目的抗原；与pTR421质粒基因免疫后的小鼠相比，pTR421-179重组质粒基因免疫小鼠后，在小鼠的血清可以检测到抗-HEV特异性IgG抗体，抗体水平呈现一定的动态变化；MTT法可以检测到pTR421-179重组质粒基因免疫后的小鼠的脾细胞在特异性抗原刺激下的增殖反应，与pTR421质粒免疫组有明显的差异。 结论： 获得了来自于一株第Ⅳ基因型HEVORF2部分cDNA序列，并在此基础上获得了含中和表位的HEV-p166和p179抗原基因编码序列；通过检测不同真核重组表达质粒在真核细胞内目的抗原的表达，发现抗原编码基因和载体的选择对抗原在真核细胞内的表达有一定的影响，同时得到了能在真核细胞内有效表达HEV中和表位的重组真核表达质粒pTR421-179；pTR421-179重组真核表达质粒基因免疫小鼠后能够激发小鼠产生一定的特异性免疫效应，为进一步基于中和表位的HEV基因疫苗的研究奠定了基础。