背景动脉粥样硬化、高血压、脑卒中等常见心脑血管疾病的发生都与血液流动时作用于血管的应力密切相关。血液动力学异常是动脉硬化发生的重要成因之一。研究血液动力学-尤其是血流剪切力与血管重构之间的关系,对于阐明动脉粥样硬化疾病的发病机制、探索新的疾病治疗方法具有潜在的理论和应用价值。动脉粥样硬化形成是一个长期的病理过程,其发病机制最主要的有脂质浸润学说、血栓形成学说、单克隆学说和损伤反应等学说。其病理生理表现包括：血管内皮细胞功能障碍、平滑肌细胞浸润增殖、炎症反应、脂质等细胞外基质沉积、斑块形成等。近期研究认为：上述诸因素并不能完全解释为何血管弯曲处和分叉处以及血液反流或有梗阻的地方更易形成斑块,血流动力学因素在AS发生条件中具有主要的作用。因为这些部位的血流动力学特点是剪切力的幅度降低,方向紊乱。而在正常状态下,体内大动脉中的血流剪切力在5～20dynes/cm2(dynes/cm2),平均约为12dynes/cm2,血管内皮细胞多呈规则的梭形排列,其长轴与血流方向平行,此时血流剪切力对血管内膜起保护作用,阻抑动脉粥样硬化的发生、发展,促进新生血管形成。而血流剪切力相对较高的区域不发生动脉粥样硬化斑块,这可能与高血流剪切力区eNOS的表达增多有关。大多数研究动脉粥样硬化发生和血流剪切力关系的实验为临床病例观察或体外实验,Cheng C等学者应用改进的血管周围剪切力诱发装置(也被成为套管)在动物体内改变血流剪切力,对比研究了不同剪切力对载脂蛋白E(apolipoprotein E)基因敲除小鼠动脉粥样硬化发生的作用,发现低血流剪切力区及振荡剪切力区所形成动脉粥样硬化斑块的性质,认为低血流剪切力斑块与振荡剪切力斑块相比,含有更多的脂质成分,而血管平滑肌细胞及胶原含量均少于振荡剪切力斑块；且在低剪切力区,动脉粥样硬化斑块更容易形成缺乏血管平滑肌细胞的薄纤维帽。血管腔的内皮细胞持续暴露在血流动力学的剪切力中,内皮细胞上的感受器能感受血流剪切力的变化,将这种机械刺激通过激活特定的信号通路调节不同基因和蛋白质的表达影响内皮细胞和平滑肌的结构和功能(如增殖、凋亡、迁移、通透性、结构重塑以及基因表达等),参与血管的重塑和疾病的发生。在人类已发现的518个蛋白激酶系统中,丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)家族在细胞内信号转导和功能调节中发挥重要作用。MAPK主要包括ERK1/2、JNK、p38和BMK/ERK5这四条经典途径,广泛参与细胞的生长、增殖到凋亡的过程。其中JNK(c-Jun NH2-terminal kinases)家族,因为它对物理、化学和生理应激刺激(如紫外线、渗透压变化、感染、细胞因子等)感受敏感也被称为应激活化蛋白激(stress-activated-MAPkinases, SAPK),是哺乳动物内发现的第三类MAPK家族。JNK在传导胞外信号至核转录因子时起着重要作用,可以提高转录能力。JNK蛋白可由3个基因编码,JNKl和JNK2基因存在于多种组织,而JNK3基因局限于在脑、心脏、睾丸中表达。JNK基因通过选择性剪接而产生10种JNK形式,激活的方式分为小G蛋白依赖性途径和小G蛋白非依赖性途径。JNK通路已被证实可被层流剪切力激活,通过G蛋白、P13K、Src以及MEKK1的上调JNK分子后结合AP-1等转录因子引起下游效应分子MCP-1、IL-8、VCAM以及胞外基质的代谢等变化在动脉粥样硬化形成中发挥作用。在给与JNK抑制剂SP60025的野生小鼠和JNK2-/-apoE-/-敲基因小鼠中均能观察到动脉粥样硬化斑块形成明显减少。这些都说明血流剪切力可以通过细胞感受器启动JNK通路调控内皮细胞的生长代谢,影响动脉粥样硬化的发生发展。另一方面,早期动脉粥样硬化发生的病理学特征被认为是促炎因子激活后影响内皮功能紊乱启动的炎症反应过程。许多实验证实剪切力通过JNK信号通路引起内皮功能改变、粘附分子(VCAM、ICAM、P选择素、E选择素等)分泌、单核一巨噬细胞募集迁移、脂质吞噬泡沫细胞生成等改变参与动脉粥样硬化的发生。但研究结果也不尽统一,有文献报道JNK2-/-apoE-/-敲基因小鼠较apoE-/-敲基因小鼠虽斑块明显减少,但VCAM等分子表达无明显差异,这与许多研究报道的JNK广泛参与炎症反应不同一致,因此有待于进一步的研究。且以往对剪切力与动脉粥样硬化形成分子机制的研究大部分通过体外细胞实验模拟血流剪切力来完成,但不能完全复制体内血流的生理状态。因此,我们将对apoE-/-基因敲除小鼠实施颈动脉套管术构建动脉粥样硬化斑块动物模型,人为造成颈动脉处低、高及振荡剪切力血流区域,用于观察不同剪切力与动脉粥样硬化形成部位,大小及稳定性的相互关系。重点研究JNK信号通路在这一过程中的作用,通过给与JNK抑制剂,分组观察不同组别间、不同剪切力在动脉粥样硬化形成的过程中与炎症反应、脂肪沉积和胶原代谢之间的相互关系。明确JNK信号传导通路在不同剪切力介导下对动脉粥样硬化斑块形成中的调节机制,为动脉粥样硬化疾病的治疗提供新的途径。目的1.构建斑块动物模型,人为改变apoE-/-小鼠颈总动脉血流剪切力,形成低、高、振荡剪切力及生理剪切力四个部位。2.采用组织学和分子生物学方法,分组观察JNK抑制剂在不同剪切力介导下对动脉粥样硬化形成的作用。3.进一步探讨JNK通路在不同血流剪切力介导下,引起的生物效应及动脉粥样硬化斑块形成过程中的分子机制。方法1.动物模型的构建和分组：8周龄左右雄性apoE-/-小鼠84只(25-30g),0.08%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠。颈部正中皮肤切开,剥离右侧颈部的腺体和肌肉,暴露右侧颈总动脉,小心分离与之伴行的迷走神经,将长度为2mm、内径为0.3mm的硅胶管(小鼠颈动脉直径为0.5mm)套置于血管外周,2端固定套管,人为造成动脉狭窄,改变此处血流速度,狭窄的近心端由于放置套管造成血液流动相对缓慢为低剪切力；套管部位血流速度较快为高剪切力；狭窄的远心端为振荡剪切力；对侧为生理剪切力。套管放置后小鼠均改用高脂食物喂养,应用小鼠体表超声技术测定不同部位血流的变化和动脉粥样硬化斑块形成的过程。分组：apoE-/-小鼠颈总动脉套管1周后均给以高脂饮食(0.25%胆固醇+15%脂肪),随机分为2组,每组42只,根据参考文献一组腹腔注射SP600125(JNK的抑制剂)0.2mg/kg/d,另外1组同等体积NS腹腔注射作为对照。套管术后10周处死,分离双侧颈总动脉、心脏、肝脏、脾脏、肾脏,脂肪组织留取标本进行检测。2.血液学指标检测：麻醉小鼠灌注血管前经心尖取血静置30分钟自凝后2500rpm离心15分钟,取上层血清,酶法检测血清中总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平。3.病理组织学检测：(1)每组取15只进行组织学标本处理,分别取材近心端(低剪切力)、套管区(高剪切力)、远心端(振荡剪切力)及对侧颈动脉(生理剪切力),标本用OCT包埋,制作6μ m冰冻切片,连续切片20张。分别行HE染色(用于软件分析斑块的形态学)、Masson染色(显示胶原)、油红0染色(显示脂质)等染色分析各组成分。(2)免疫荧光检测：免疫荧光双标VCAM-1和vWF检测重点观察两组间各不同剪切力部位内皮表达VCAM-1的不同,阐明剪切力的变化与JNK信号通路的调节与粘附分子之间的关系。(3)组织病理学测量：根据每个标本连续切片的组织学染色结果,H&E染色后光镜下摄片,用ImagePro-Plus软件测量血管中层壁厚(MT)和管腔内径(LD),每个标本测量5次,取平均值,并计算二者的比值(MT/LD)。通过直线相关分析判定内中膜厚度,管腔面积和血流剪切力的关系。使用图象分析软件IPP测量VCAM-1的荧光强度变化,比较不同部位的炎症反应程度。4.实时定量PCR(RT-PCR)检测：各组动物取10只颈动脉分段取材近心端(低剪切力)、套管区(高剪切力)、远心端(振荡剪切力)及对侧颈动脉(生理剪切力)新鲜标本,同组同侧提取组织RNA,RT-PCR方法检测ICAM-1,VCAM-1等的表达。5.Western blot检测：取新鲜颈动脉斑块标本,按实验分组分段提取蛋白,采用Western blot方法检测不同部位ICAM-1, VCAM-1,NFκB, JNKl/2的蛋白表达。结果1.M型超声成像评价和血脂水平检测小动物超声M型超声评价套管术后3天近心端(低剪切力区)与对侧颈动脉(生理剪切力)相比,血流速度(Vmax)明显减低,根据公式SS=4μVmax/Ds计算所得的剪切力数值明显低于生理剪切力(P<0.05)。术前及取材时的血脂水平比较结果显示,两组TC及LDL这两个主要的影响动脉粥样硬化发生的指标没有明显差别(P>0.05),说明JNK抑制剂SP600125对循环中的血脂水平没有明显影响,两组间饮食中及血清中血脂水平无明显差异。2.抑制JNK活性明显减少LSS和OSS部位的动脉粥样硬化的发生组织学切片过程中发现,对照组(NS组)的LSS部位及OSS部位斑块的发生率分别为100%和62.5%,两部位比较也有统计学差异(P<0.05),而在HSS和对侧USS部位均无斑块发生。JNK抑制剂组LSS和OSS部位斑块发生率均为13.3%,与同部位的NS组相比明显降低(P<0.05)。HE染色后测量颈动脉内膜-中膜比值(I/M)结果显示生理盐水组LSS部位斑块体积明显大于OSS部位(1.21VS.0.42；P<0.05),HSS及USS部位无明显差异(P>0.05)。JNK抑制剂组LSS及OSS部位与生理盐水同部位相比明显降低(0.02,0.07VS.0.42,1.21；P<0.05)。3.抑制JNK活性后颈动脉各剪切力部位斑块成分的影响油红0检测脂质含量的染色中发现,JNK抑制剂组各部位均无斑块发生,故检测到的脂质含量均较生理盐水组低(P<0.05),而在生理盐水组LSS及OSS部位有明显脂质成分(P<0.05),其中LSS部位较之OSS部位有更明显的脂质含量增高(45.53%VS.13.48%,P<0.05)。MASSON染色观察平滑肌与胶原含量,结果发现斑块发生的两个部位LSS及OSS比较,生理盐水组中LSS较OSS部位胶原含量稍低及平滑肌含量稍高,但无明显统计学差异(P>0.05)。JNK抑制剂组较生理盐水组比较胶原含量稍有升高(24.41%VS17.62%.,P>0.05)而平滑肌含量降低(21.24%VS.26.17%,P>0.05),两组并无统计学差异。4.抑制JNK活性后明显减少LSS及0SS引起的粘附分子等相关分子的表达RT-PCR检测基因表达结果发现,生理盐水对照组中,与USS部位比较,VCAM-1表达明显升高,LSS及OSS部位分别升高12.5倍和4.3倍(P<0.05),而HSS部位无明显差异(P>0.05)。JNK抑制剂明显减少LSS和OSS引起的VCAM-1表达(P<0.05)。Western Blot及免疫荧光检测所得的VCAM-1蛋白表达结果均显示,LSS及OSS部位有明显升高(P<0.05),且LSS较之更高(P<0.05)。而JNK抑制剂组VCAM-1表达均生理盐水组较同一部位明显降低(P<0.05)。进一步检测SP600125对JNK的抑制率,Western Blot显示JNK抑制剂组各部位p-JNK表达均明显降低(P>0.05)。而且,与炎症反应明显相关的转录因子NFκB的活性成分p-p65的表达量在JNK抑制剂组明显低于同部位的生理盐水对照组(P<0.05)。结论1.颈动脉套管人为改变apoE-/-小鼠颈动脉内不同血流剪切力后小动物M型超声测量低剪切数值,证实模型是成功的。2.LSS和OSS均促动脉粥样硬化发生,且LSS的作用更明显；而HSS及USS则显示保护性作用。JNK抑制剂SP600125明显减少LSS及OSS所诱发的动脉粥样硬化的发生。3.抑制JNK基因表达后,相关的VCAM-1、ICAM-1及PECAM-1表达相应发生改变,说明JNK参与了LSS及OSS诱发的VCAM-1表达影响动脉粥样硬化的发生。背景动脉粥样硬化斑块的形成始于血流紊乱,内皮下脂质(LDL)沉积,内皮功能异常,炎症反应加剧。大量研究表明炎症在动脉粥样硬化性成和发展中起重要的作用,从VCAM参与脂质条纹的形成,到ox-LDL及其他炎症因子趋化单核细胞等炎性细胞参与斑块增生,最后纤维帽边缘巨噬细胞募集和基质酶等参与下斑块破裂。在稳定层流作用下内皮细胞分泌一氧化氮、前列环素、利尿钠肽、乙酰肝素及SOD等分子来对抗炎症因子的作用延缓动脉硬化的发生。相反,动脉粥样硬化的发生和进展多在涡流区和低剪切力部位,许多研究也发现低剪切力作用可通过激活转录因子,如NFκB、Egrl (Early growth response1)和API (Activator protein1)等作用来调节炎症的反应,由于NFκB是重要的致炎和致动脉粥样硬化的转录因子,其靶基因如MCP1、ICAM和VCAM的高表达能促进白细胞的聚集和炎症反应。另外在低剪切力区域NF K B激活后,由于NFκB和NO之间的负反馈调节可导致eNOS和其产物NO表达减少参与动脉硬化形成。血管腔的内皮细胞持续暴露在血流动力学的剪切力中,内皮细胞上的感受器能感受血流剪切力的变化,将这种机械刺激通过激活特定的信号通路调节不同基因和蛋白质的表达影响内皮细胞和平滑肌的结构和功能(如增殖、凋亡、迁移、通透性、结构重塑以及基因表达等),参与血管的重塑和疾病的发生。JNK信号通路广泛参与动脉粥样硬化发生的各阶段；而且剪切力通过JNK信号通路引起内皮功能改变、粘附分子(VCAM、ICAM、P选择素、E选择素等)分泌、单核一巨噬细胞募集迁移、脂质吞噬泡沫细胞生成等改变参与动脉粥样硬化的发生。血管内皮细胞表面装配有很多的能感受和传导剪切力的机械力感受器。最近的研究表面,PECAM-1(CD31)除了作为内皮细胞表面标志蛋白外,其感受和传导血流剪切力并进一步调节内皮细胞内信号传导的作用也渐被人重视。CD31能通过激活NFκB和Akt途径在血管重塑过程中调节炎症细胞募集方面发挥重要作用。另一方面,许多体内和体外实验证实CD31通过调节NFκB促进紊乱血流区域动脉粥样硬化的斑块形成。Cuhllmann等研究者报道血流紊乱能上调内皮细胞NFκB活性经由JNK-ATF2信号通路促进动脉管壁炎症的发生。但有些研究显示PECAM1敲基因小鼠并不能激活血流紊乱部位的NF K B和其下游的炎症基因表达。而且此感受器信号传导通路研究并不是十分一致,比如血管内皮细胞中MAPKs(ERK1/2,p38)和AKT通路磷酸化激活有时不依赖于CD31活化。因此我们在实验中重点关注LSS引起的内皮细胞炎症因子的释放是否有JNK参与的信号传导,并且是否有CD31感受传导和NF K B的激活参与。目的1.通过检测VCAM-1表达变化验证文献中4dye/cm2作为低剪切力刺激下的时间依赖性作用,为以下的体外实验选定刺激条件。2.在蛋白水平上比较LSS刺激下JNK表达变化印证体内实验中JNK的作用,进一步通过干扰和抑制剂等方式观察NFκB的表达,推测JNK-NFκB-VCAM1转导通路的可能性。3.进一步探讨PECAM1作为机械力感受器在LSS引起的炎症反应中调节JNK一NFκB-VCAM1表达的作用,初步提出其引起的生物效应新的分子机制。方法1.细胞培养和体外剪切力模拟装置刺激：HUVECs购买自美国ATCC公司,含5%胎牛血清的ECM培养基传代培养,细胞传至第4代进行试验。购买一种Flex5的层流板模拟装置设定4dyn/cm2作为低剪切力刺激细胞。2. siRNA体外转染：HUVECs细胞刺激前分组转染330pmol的人CD31或人JNK1/2的小干扰RNA,混合lul脂质体2000稀释到3ml的Opti-mem培养基中,干扰6小时后或10μ mol/L SP600125抑制剂15分钟后再给予LSS刺激。3.实时定量RT-PCR:LSS或对照组细胞提取RNA后,统一到每一反应体系1μg,按照比例加入反应体系。引物序列为VCAM-1(正义)5’-ATGACATGCTTGAGCCAGG-3’和(反义)5’-GTGTCTCCTTCTTTGACACT-3’;β-actin(正义)5’-TGGACATCCGCAAAGAC-3’和(反义)5’-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3’.PCR反应解链95℃5min,扩增36循环95℃10秒,退火56℃30秒,延伸72℃30秒VCAM-1相对表达标准化比β-actin。4.细胞免疫荧光检测：HUVECs经过4%甲醛固定,PBS冲洗后用正常血清封闭,4℃孵育一抗过夜：兔抗鼠p-JNK,兔抗鼠p-NFκB p65。Alexa488结合的驴抗兔的二抗孵育后用含DAPI的封片液封片,激光共聚焦照相保存,Image Pro Plus6.0软件分析表达量。5.Western blot检测：各组刺激后HUVECs收集提取全蛋白,统一浓度到2mg/ml。10%SDS-PAGE电泳后转到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭后TBST洗3次,孵育一抗4℃过夜：兔抗人β-actin,兔抗人t-JNK和p-JNK,大鼠抗人CD31和山羊抗人VCAM-1。TBST冲洗后孵育相应二抗后化学发光液测表达变化。6.数据分析：结果表示为均数±标准差,SPSS16.0软件统计分析。结果1.VCAM-1表达变化与LSS刺激呈时间依赖性LSS4dyn/cm2刺激HUVECs不同时间(0,6,12,18,24hr)后,VCAM-1表达在RNA水平和蛋白水平检测均呈现先生高后减低的趋势,其中以12小时处较对照表达最高(P<0.05),因此以下的实验均采用此刺激条件,即LSS刺激12小时观察各检测指标变化。2.LSS刺激下JNK和NF-κB表达变化与VCAM-1呈现相关性JNK活性(p-JNK/t-JNK)在LSS刺激后的HUVECs中明显升高(4.34-fold,P<0.05),同时LSS刺激12小时后活化的NF-κB(p-p65)表达也明显升高(1.89-fold, P<0.05)。3.CD31和JNK的小干扰RNA的干扰效率检测LSS刺激前首先转染si-CD31或si-JNK以及各自的阴性对照小干扰RNA用来减少目的片段CD31或JNK1/2的表达。通过Western blot检测比较后证实si-CD31(0.35±0.04vs.1.00±0.10对照组；0.30±0.02vs.1.54±0.14低剪切力组；P<0.05)或si-JNK(0.43±0.09vs.1.00±0.12对照组；0.57±0.13vs.1.86±0.11低剪切力组；P<0.05)均明显减少各自蛋白表达。4.抑制CD31表达后明显减少LSS刺激下的JNK活性变化LSS刺激下JNK活性明显上调(P<0.05),经si-CD31预处理后再给予LSS刺激的JNK活性分别下降24.68%(对照组)和31.16%(低剪切力组)(P<0.05)。细胞免疫荧光检测的p-JNK表达变化趋势大致与Western blot结果一致,除了对照组si-CD31预处理后p-JNK减少程度较无干扰组减少无统计学差异。提示CD31参与LSS介导的JNK信号分子的生物学作用。5.JNK活性抑制后明显减少NF-κB和VCAM-1的表达细胞免疫荧光检测显示经si-JNK或SP600125预处理HUVECs后,LSS引起的p-p65表达升高被显著抑制(1.05±0.06和1.16±0.05vs.2.27±0.08；P<0.05),Western blot蛋白定量分析显示相似的结果(P<0.05)。p-p65和VCAM-1水平的变化呈现明显的相关性(r2=0.992,P<0.01)。结论1.体外细胞实验中,HUVECs表达VCAM-1的变化与LSS刺激呈明显的时间依赖性关系,选择LSS刺激12小时作为后续实验的刺激条件。2.JNK的小干扰si-JNK和抑制剂SP600125均能减少LSS引起的HUVECs细胞内NFκB活性和VCAM-1表达量,提示LSS引起VCAM-1表达升高可通过JNK-NFκB途径。3.特异性siRNA减少CD31表达后,LSS刺激下JNK和VCAM-1表达均明显下降,提示CD31至少作为其中之一的机械力感受器参与LSS引起的HUVECs细胞内JNK-NFκB-VCAM1信号转导通路过程。