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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种神经退行性疾病,神经细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)和细胞外老年斑沉积是其主要的两大病理表现。近年来针对Aβ进行免疫治疗的失败,使得研究者把更多的目光投向tau蛋白。Tau蛋白在AD脑中的动态演变过程与AD的严重程度密切相关。而tau蛋白过度磷酸化是其毒性作用的中心环节。目前中药复方对以tau蛋白过度磷酸化为靶点的研究还不够深入。课题采用的中药复方扶正祛邪方针对AD元气不足,络脉瘀阻,毒邪积聚的病机以补虚活血解毒为原则进行组方,具有良好的前期实验研究基础和中医理论基础,是具有开发潜力防治AD的药物。由于中药治疗疾病具有多靶点和治未病的优势,本研究应用扶正祛邪方对具有快速老化并能够在低月龄表现出AD特征性病变的SAMP8小鼠进行早期干预,以观察其对SMAP8小鼠学习记忆行的影响,探讨其防治tau蛋白过度磷酸化的作用机制,为其临床治疗及运用提供科学依据。目的：以扶正祛邪为治则早期干预快速老化SAMP8小鼠,观察中药复方对SAMP8小鼠行为学、脑组织海马病理形态表现、及NMDAR/PP2A/tau通路相关蛋白表达的影响,探讨中药复方对SAMP8小鼠认障碍药理作用,及其可能的调控机制。方法：实验选用3月龄的SAMP8小鼠40只,随机分为四组：模型对照组(PCG),阳性对照美金刚组(MG),复方小剂量组(FLG)和复方大剂量组(FHG)。并设有SAMR1正常对照组(RCG)。各组小鼠进行3个月的灌胃干预,其中MG、FLG和FHG分别给予相应的药物干预,而RCG和PCG组则给予等体积的蒸馏水。灌胃结束后进行水迷宫检测、脑组织病理形态观察和NMDAR/PP2A/tau通路相关蛋白的表达的测定。第一部分,行为学检测,通过Morris水迷宫定位航行实验来评价小鼠的空间学习能力,通过空间探索实验来评估各组小鼠的空间记忆能力。第二部分,脑组织海马病理形态观察,在行为学结束后,每组随机选取5只小鼠,进行脑组织海马CA1区的HE染色,观察CA1区神经元的数量及形态变化；尼氏染色,观察海马CA1区神经元中尼氏小体的数量、形态、分布等。第三部分,另一侧脑组织海马快速分离,液氮冻存,应用Western blot检测NMDAR/PP2A/tau通路相关蛋白的表达。比较各组PP2A c, P-PP2A, P-TAU(S396), TAU-5, NR2A和NR2B表达的差异,探讨相关蛋白之间的关联性及在AD疾病进展中的意义,探讨扶正祛邪方防治AD的作用机制。结果：1扶正祛邪方早期干预对SAMP8小鼠行为学的影响。定位航行结果显示：第一天,各组潜伏期数据差异无统计学意义(P>0.05)。相同组别内,各组小鼠第五天的潜伏期都较第一天缩短(P<0.05或P<0.01)。其中RCG和FHG在训练第二天就表现出明显的学习能力(P<0.05或P<0.01),FLG对学习能力的改善出现在训练第四天(P<0.05),而MG和PCG则出现在第五天(P<0.05或P<0.01)。同一天内,与RCG相比,PCG小鼠潜伏期在第四、第五天均较长(P<0.01)；与PCG相比MG、GLG、FHG分别在第五天(P<0.05)、第四天(P<0.01)与第二天(P<0.05)与之出现显著差异。同时,各组小鼠定位航行训练第一天与最后一天的轨迹图也存在一定的差异。空间探索结果显示：与RCG相比,PCG的穿台次数(P<0.01),第一象限游泳时间(P<0.05)及第一象限游泳路程下降(P<0.01)；MG和FLG第一象限游泳路程与RCG相比,差异有统计学意义(P<0.05)；而RCG与GHG的差异不具有统计学意义(P>0.05)。与PCG相比,用药干预的各组在游泳路程,穿台次数上都有所增加。其中MG与PCG相比,穿台次数增加(P<0.05)。FHG在第一象限游泳时间较PCG增加(P<0.05)。2扶正祛邪方早期干预对SAMP8小鼠海马病理形态的影响。HE染色显示：镜下RCG小鼠病理形态显示,海马CA1区组织细胞胞界限清楚,排列整齐,紧凑,细胞层数较多；PCG小鼠CA1区细胞边界不清,细胞排列散乱,细胞间剧增宽,游离细胞增加,细胞层数减少,胞核出现固缩深染,甚至细胞核消失,出现较多红色神经元(墓碑细胞)；MG、FLG、FHG小鼠CA1区病理形态较PCG有不同程度的改善,细胞排列尚整齐,细胞层数较多,异形性细胞较少,红色神经元数目较少。尼氏染色显示：RCG小鼠海马CA1区细胞排列整齐,层数较多,且神经元数量较多,细胞浆内的尼氏小体数量较多,胞浆呈深蓝染色,核呈淡蓝色；PCG小鼠的海马CA1区神经元层数明显减少,排列较乱,神经元出现变形肿胀趋于圆形,胞质淡染,尼氏体崩解为细颗粒状向外扩展或消失,核有固缩现象,核染成深蓝色；MG、FLG、FHG小鼠海马CA1区神经元排列较齐,神经元的数量明显增多,胞浆染色较深,胞浆内可见较多的尼氏小体,细胞核固缩得到缓解。3扶正祛邪方早期干预对SAMP8小鼠NMDAR/PP2A/tau通路的影响。与PCG相比,RCG、MG、FLG和FHG的P-PP2A表达均明显增加(P<0.01)。与PCG相比,PP2Ac只有RCG的表达增加(P<0.05),然而MG、FLG和FHG与RCG的表达无明显差异(P>0.05)。与PCG相比,RCG的TAU-5表达未见明显差异表达(P>0.05),而MG、FHG的TAU-5表达较PCG明显减少(P<0.05或P<0.01),且MG的TAU-5表达还较FLG显著减少(P<0.05)。与PCG相比RCG的P-TAU(S396)表达未见明显差异表达(P>0.05),而MG、FHG的P-TAU(S396)表达较PCG明显减少(P<0.05或P<0.01),但RCG、MG、FLG和FHG的P-TAU(S396)表达未见显著差异(P>0.05)。就NR2A的表达而言,与PCG相比,RCG、MG、FLG和FHG的NR2A表达均有显著增加(P<0.05或P<0.01),RCG与用药各组间NR2A表达无显著差异(P>0.05)。对于NR2B的蛋白表达水平,五组间无显著差异(P>0.05)。结论：扶正祛邪方早期干预对SAMP8小鼠行为学的影响。Morris水迷宫实验表明：6月龄的SAMP8小鼠与SAMR1小鼠相比出现明显的空间学习、记忆储存和记忆提取能力的下降——认知功能的下降,是其海马功能受损的表现。中药复方扶正祛邪方的早期干预对SAMP8小鼠空间学习能力及记忆储存、提取能力具有改善作用,其对海马损伤有明显的保护作用。扶正祛邪方早期干预对SAMP8小鼠海马病理形态的影响。脑组织海马病理形态学观察,发现6月龄的SAMP8小鼠海马CA1区神经元出现变性,甚至死亡、消失,数量减少。扶正祛邪方早期干预对预防SAMP8小鼠海马CA1区神经元的增龄性神经退变有一定作用。扶正祛邪方早期干预对SAMP8小鼠NMDAR/PP2A/tau通路的影响。各组小鼠PP2Ac, P-PP2A, P-TAU(S396), TAU-5, NR2A和NR2B的表达显示：6月龄SAMP8小鼠海马tau S396位点出现高度磷酸化,tau蛋白的总量表达增加,并且PP2Ac和NR2A的表达减少。而西药美金刚和中药小复方扶正祛邪方可以逆转这些表达,并且其可能的机制为：药物提高海马突触NR2A表达,抑制NR2B的过度激活(尚待证实),从而提高PP2A的表达及其在PP2A-NMDAR复合体的活性,从而达到抑制tau蛋白过度磷酸化的目的。总之：6月龄的SAMP8小鼠已经出现了明显的空间记忆障碍,神经元出现了明显的数量减少和功能退化,甚至死亡。造成这些病变可能的原因是其突触受体功能及表达的异常,使蛋白磷酸酯酶PP2A表达下降,导致tau蛋白发生过度磷酸化,而突触的异常及tau蛋白的过度磷酸化所介导的毒性作用造成小鼠海马神经元的损伤,进而影响记忆的储存和提取。中药复方扶正祛邪方可能通过上述NMDAR/PP2A/tau途径保护神经细胞,改善小鼠的学习记忆能力。中药复方早期干预对SAMP8小鼠的认知障碍的发生发展具有预防和保护作用。