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目的：肌浆网(sarcoplasmicreticulum，SR)通过2型ryanodine受体(RyR2)释放的Ca2+是调控成熟心肌细胞兴奋收缩耦联的关键信号；但在胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)分化的心肌细胞和胚胎期心肌细胞中，SR的调控作用还不清楚。因此本课题研究目的旨在阐明在心肌细胞分化发育过程中胞浆内Ca2+浓度(intracellularCa2+concentration，[Ca2+]i)以及钙瞬变的变化规律；确定SR在分化发育早期心肌细胞钙稳态和细胞收缩调控中的作用；探讨心肌细胞肌膜上Ca2+离子通道/交换体在细胞分化发育过程中对钙稳态的调控作用，以进一步阐明心肌细胞分化发育过程中钙稳态调控机制的变化规律；同时探讨ES细胞分化的心肌细胞(EScell-derivedcardiomyocytes，ESCMs)在功能上能否发育成为移植治疗所需的心肌细胞。
方法：本课题首先建立了ES细胞的培养扩增方法，并建立起诱导ES细胞分化为心肌细胞的分化体系以及心肌细胞分离的方法。在分化发育的各不同阶段，分离出能自主收缩的心肌细胞，检测了各Ca2+释放通道或受体的在发育过程中的表达；系统地研究分析了在细胞分化发育过程中ESCMs钙瞬变和收缩的各项动力学指标。同时应用已建立的基因剔除RyR2(RyR2-/-)ES细胞系，结合应用药理学方法，研究分析各Ca2+调节通道/受体尤其是SR在分化发育早期心肌细胞中对钙稳态的调控作用。
结果：在正常ES细胞分化为心肌细胞的过程中，胞浆内基础钙离子浓度逐渐升高，心肌细胞发生自发钙瞬变的频率逐渐增快，钙瞬变和细胞收缩的幅度逐渐增大、时程逐渐缩短。在分化的各个阶段，正常心肌细胞的钙瞬变能被高浓度ryanodine和SR上钙泵(sarcoplasmic/endoplasmicreticulumCa2+ATPase，SERCA2a)抑制剂thapsigargin明显抑制。SR上钙离子调控蛋白RyR2、SERCA2a、phospholamban在心肌细胞分化早期就已经有高水平表达，到分化晚期SR内集钙蛋白(calsequestin)才出现表达，同时心肌细胞SR中Ca2+的容量随着细胞分化逐渐升高。在RyR2功能性剔除的RyR2-/-ESCMs中，发生自发钙瞬变的频率明显降低，钙瞬变以及细胞收缩的时程显著延长。从分化的早期开始，β-肾上腺素受体对ESCMs钙瞬变和收缩就有正性调控作用，并随着分化发育而逐渐增强；但在RyR2-/-心肌细胞中β-肾上腺素受体的作用明显减弱。这都提示着在分化的早期ESCMs中，SR的RyR2已经具有调控钙瞬变和细胞收缩的功能，其功能随着细胞分化逐渐增强。心肌细胞SR上释放Ca2+的二型三磷酸肌醇受体(type2inositoltriphosphatereceptor，IP3R2)抑制剂2-APB能明显抑制发育各期ESCMs钙瞬变的幅度，其作用在发育早期更为明显，说明在分化发育早期ESCMs中IP3R2也参与钙瞬变的调控，其调控作用随细胞分化发育逐渐变弱。
无Na+灌流液可以抑制钠钙交换体(Na+/Ca2+exchanger，NCX)的正向排钙功能；ESCMs经无Na+灌流液处理后，胞浆内[Ca2+]i明显升高，但直到分化后期才能观察到无Na+灌流液对ESCMs钙瞬变的抑制。在RyR2-/。ESCMs上能检测到比正常ESCMs更大的L-型Ca2+电流。低剂量nifedipine(1μmol/L)能明显抑制心肌细胞钙瞬变，其抑制效应随心肌细胞分化有减弱的趋势。
结论：在心肌细胞发育过程中，ESCMs胞内基础[Ca2+]i逐渐升高，能诱发出更强更快的自发钙瞬变；其钙稳态的调控机制也发生着动态的变化。在分化的早期阶段，SR钙库和RyR2以及IP3R2就已经调控心肌细胞钙瞬变和细胞收缩的频率以及收缩的速率，并在心肌细胞对β-肾上腺素受体的药理性反应中起非常重要的作用；SR和RyR2对细胞收缩的调控功能是随着心肌细胞的分化而逐渐增强。肌膜上L-型Ca2+通道调控心肌细胞钙瞬变的功能呈逐渐下降的趋势。本课题研究成果在理论上进一步丰富了发育早期心肌细胞钙稳态的调控机制；在体外证明了ES细胞分化的心肌细胞已初步具有与成体心肌细胞相似的兴奋收缩藕联调控功能，具有临床治疗缺血性心脏病的应用潜能，为ES细胞用于心肌细胞移植提供了有力的实验证据。